[發明專利]當歸四逆湯抗寒凝血瘀證差異代謝物代謝通路及研究方法

在審

• 申請號: 201911128114.3
• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN110794074A
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 蘇志恒;黃慧敏;吳金霞;鄭華;程邦;宋慧;郭宏偉;梁永紅
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 11369 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 靳浩

1.當歸四逆湯抗寒凝血瘀證差異代謝物代謝通路及研究方法，其特征在于，包括：

采用超高效液相色譜串聯質譜檢測分析冰水浴加腎上腺素誘導雌性大鼠形成寒凝血瘀證及當歸四逆湯干預后的不同時間點變化的內源性代謝產物，獲得指紋圖譜；

利用多元變量統計分析方法，從多個變量中篩選并鑒定出二十一個顯著發生變化的代謝物，作為與寒凝血瘀證發生發展潛在相關差異代謝物；

通過metaboanalyst開源在線代謝組學分析網站，富集出與寒凝血瘀證不同發展時期相關的八條代謝通路。

2.如權利要求1所述的當歸四逆湯抗寒凝血瘀證差異代謝物代謝通路及研究方法，其特征在于，獲得當歸四逆湯抗寒凝血瘀證的差異代謝物代謝通路的具體步驟如下：

(1)當歸四逆湯的制備

將當歸12g、桂枝9g、白芍9g、細辛3g、通草6g、炙甘草6g、大棗12g置于1000mL圓底燒瓶中，先用重量為上述組分重量8倍的蒸餾水浸泡1h，接著在常壓、100℃下進行加熱回流提取2h，收集第一次提取液，保留濾渣；

向1000mL圓底燒瓶中加入重量為上述組分重量6倍的水，將濾渣繼續加熱回流提取2h，收集第二次提取液；

合并第一次提取液和第二次提取液，并用200目紗布過濾；

將過濾后的濾液置于真空旋轉蒸發儀中，于60℃條件下進行濃縮至最終濃縮液濃度為2.0g/mL，即得當歸四逆湯；

(2)動物模型的確定

將24只雌性大鼠適應性喂養一周后，按照隨機數字法隨機分為空白組、模型組、DSD治療組，每組8只，將模型組和DSD治療組的大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳，當大鼠出現反應遲鈍、呼吸微弱、腿部僵直欲溺水時取出，每天刺激一次，持續刺激14天；根據平行對照原則，空白組大鼠則被置于35-37℃水浴中游泳5-10min，每日游泳1次，連續游泳14天；當實驗進行至第10天時，在模型組和DSD治療組的大鼠皮下注射鹽酸腎上腺素兩次，間隔為4小時，劑量為0.8mg/kg；在第一次注射結束后2h，將模型組和DSD治療組大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳5min，空白組大鼠則被置于35-37℃水浴中游泳5min；

本研究的給藥方法為：在建模期間DSD治療組每天灌胃當歸四逆湯，劑量為1.8mg/g，空白組和模型組則平行給與等劑量的蒸餾水灌胃，每天一次，持續14天；

(3)大鼠尿液的采集、保存和前處理

在動物造模期間的第0，5，10，14天，收集每組大鼠晚上20：00到早晨8：00這一時間段的尿液樣本，并分別用5mL離心管采集尿液樣本后，將各根離心管埋于冰盒中，使各個尿液樣本均處于0-4℃；

從每個尿液樣本中取出等量的600μL尿液樣本后，向每個尿液樣本中加入質量濃度為0.1％的疊氮化鈉，之后將各根離心管在-80℃下凍存；

在室溫解凍各個尿液樣本，并將各個尿液樣本用600μL的去離子水進行稀釋，接著將各個尿液樣本離心去沉淀，再將各個尿液樣本通過0.22微米聚偏二氟乙烯濾膜過濾后，分別裝入進樣小瓶，之后從每個樣本中取10μL尿液樣本混合在1個新的離心管中制成質量控制QC樣本；

(4)尿液樣本的超高效液相色譜串聯質譜檢測分析

(5)數據預處理

采用Masslynx軟件對采集到的超高效液相色譜和質譜檢測數據進行去噪音、質譜峰提取、峰排列、峰對齊及歸一化處理，得到各個峰的峰高或者峰面積及保留時間；

(6)利用多元變量統計分析代謝輪廓差異和動態變化

將預處理后的數據導入SIMCA-P14.1軟件，將數據采用Par縮放方法進行預處理，之后對空白組、模型組、QC樣本進行主成分分析，對不同時間點收集的空白組，模型組和DSD治療組尿液樣本進行PCA軌跡分析，對空白組，模型組以及DSD治療組進行偏最小二乘法判別分析；

(7)篩選潛在生物標志物

以空白組和模型組預處理后的超高效液相色譜和質譜檢測數據建立正交偏最小二乘法分析模型，對兩組間的差異代謝物進行篩選，采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理；差異代謝物的篩選條件為：選擇變量重要性投影值>1，且差異在兩組間具有統計學意義；

(8)潛在生物標志物的鑒定

根據變量所對應的精確質量數和二級特征碎片，通過檢索公共數據庫KEGG、HMDB和METLIN對潛在生物標志物進行鑒定，并與有描述代謝物鑒定質譜信息的文獻進行比較，最終共鑒定二十一個與BSS發生發展相關的差異代謝產物：1-甲基煙酰胺、肌酐、N-甲基組氨酸、酪胺葡萄糖醛酸、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、3-羥氨苯甲酸、亮氨酸-脯氨酸、2-苯乙酰胺、吲哚啉、2-甲基-1,2,3,4-四氫-6,7-異喹啉二醇、黃尿酸、3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸酯、馬尿酸、核黃素、苯乙酰甘氨酸、5-甲氧吲哚乙酸酯、皮質酮、別膽酸、四氫皮質酮；

(9)代謝通路富集分析

將鑒定出的二十一個差異代謝產物上傳到metaboanalyst開源在線代謝組學分析網站，錄入不同天數尿液代謝物名稱，將代謝產物名字標準化后，選擇大鼠物種的KEGG數據庫，進行相關通路的富集；對BSS大鼠不同時期尿液中顯著受影響的代謝通路進行富集分析和拓撲分析，共富集得到八條代謝通路：煙酸和煙酰胺代謝通路、淀粉和蔗糖代謝通路、組氨酸代謝通路、戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路、色氨酸代謝通路、苯丙氨酸代謝通路、核黃素代謝通路和類固醇激素生物合成代謝通路。