[發(fā)明專利]一種區(qū)分ASFV野毒株與雙基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測材料及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911127987.2
• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN111074000B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈永義;張旭;陳瑞愛;沈雪娟;李延鵬;張文炎
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué);肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

本發(fā)明公開了一種區(qū)分非洲豬瘟病毒野毒株與CD2V和/或360?505R基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測材料及試劑盒，檢測材料包括引物和探針，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1～9所示。本發(fā)明利用三組引物探針進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增非洲豬瘟病毒P72、CD2V和360?505R基因，減少了鑒定不同基因的檢測成本和檢測時間；可以辨別毒株是否存在基因的缺失，且具有良好的特異性及靈敏度。對于傳統(tǒng)qPCR，每次僅擴(kuò)增一個基因來說，本發(fā)明每次PCR反應(yīng)同時擴(kuò)增3個基因，成本降低了約2/3。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒株鑒別技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種區(qū)分ASFV野毒株與雙基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測材料及試劑盒。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African?swine?fevervirus，ASFV)，可引起急性出血熱，導(dǎo)致豬的大量發(fā)病率和死亡率事件(死亡率接近100%)。世界動物衛(wèi)生組織?(OIE)?將其列為必須報告動物疫病,?我國將其列為一類動物疫病。從2018年第一例非洲豬瘟在我國爆發(fā)來，非洲豬瘟對我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大的損失，嚴(yán)重影響我國的養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。非洲豬瘟疫情已經(jīng)擴(kuò)散到亞洲多個國家。非洲豬瘟對我國乃至亞洲國家的影響將會持續(xù)很長時間。

非洲豬瘟病毒屬于DNA病毒目，非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬成員，是一種具有20面體結(jié)構(gòu)，直徑為175~215nm，基因組全長170~190kb，含有151個開放閱讀框，可編碼150~200種蛋白，具有囊膜的雙股線性DNA病毒。

目前CN110093324A公開了一種可作為疫苗的基因缺失減毒非洲豬瘟病毒及疫苗以及構(gòu)建方法，采用非洲豬瘟中國流行株P(guān)ig/CN/HLJ/2018，經(jīng)基因工程技術(shù)，將非洲豬瘟病毒的毒力基因缺失，獲得MGFMGF360-505R缺失和CD2V與MGFMGF360-505R聯(lián)合缺失的基因缺失病毒。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明所述兩種毒株均能提供對非洲豬瘟中國流行強(qiáng)毒株的100％免疫保護(hù)，可作為安全和有效的防控中國非洲豬瘟疫情的疫苗，具有極大的社會價值。但該疫苗的使用會導(dǎo)致常規(guī)方法檢測非洲豬瘟病毒結(jié)果鈞為陽性，無法區(qū)分野毒感染致陽性，還是疫苗接種導(dǎo)致陽性。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對其建立了普通PCR診斷，SYBRGreen實(shí)時熒光定量PCR等核酸技術(shù)進(jìn)行ASF的檢測，表現(xiàn)出了很高的靈敏度。但這些方法主要檢測P72這個保守性衣殼蛋白基因，無法區(qū)分野毒株還是基因缺失株感染。因此本發(fā)明通過建立三重?zé)晒舛縋CR的方法，同時檢測非洲豬瘟病毒CD2V，MGF360-505R和P72基因，可以有效區(qū)分野毒株還是基因缺失株感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明第一個方面的目的，在于提供一種用于區(qū)分非洲豬瘟病毒野毒株與CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測材料。

本發(fā)明第二個方面的目的，在于，提供一種區(qū)分非洲豬瘟病毒野毒株與CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒。

本發(fā)明第三個方面的目的，在于提供一種三重?zé)晒舛縋CR鑒別非洲豬瘟病毒野毒株與CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速區(qū)分方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的一個方面，提供一種用于區(qū)分非洲豬瘟病毒野毒株與CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測材料，包括以下3組上游引物、下游引物和特異性熒光探針，

A組：

上游引物ASFV-P72-F：

TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ?ID?NO：1）；

下游引物ASFV-P72-R：

ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ?ID?NO：2）；