[發明專利]一種基于固相萃取的液相-液相二維色譜測定NNK及其代謝物的系統和方法

有效

• 申請號: 201911112232.5
• 申請日: 2019-11-14
• 公開（公告）號: CN110824077B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 李晶;楊葉昆;劉欣;孔維松;黃海濤;許永;王晉;米其利;高茜;向海英;曾婉利;楊光宇;李雪梅;汪偉光
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;G01N30/88
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;亢能

本發明涉及一種基于固相萃取的液相?液相二維色譜測定NNK及其代謝物的系統和方法。該方法是將制備好的樣品進樣后通過一級色譜高效凈化，切割一級色譜中NNK和NNAL流出的部分餾分，切割的餾分用稀釋泵稀釋降低餾分的溶劑強度，通過混合器混合后再通過固相萃取柱富集。固相萃取富集完成后，通過閥切換，用二級色譜的分析泵輸送流動相，從和樣品富集相反的流向把固相萃取柱上富集的NNK和NNAL洗脫下來，并通過超高效液相色譜柱分離、串聯質譜檢測。本發明方法可同時實現樣品的高效凈化和高倍數富集，方法的分析靈敏度大大提高，分析樣品前處理得到了很大的簡化，可準確測定血液和尿液樣品中ng/L數量級的NNK和NNAL。為吸煙與健康的相關性研究提供了靈敏、準確、可靠的新方法。

技術領域

本發明一種測定NNK及其代謝物的系統，尤其是一種基于固相萃取的液相-液相二維色譜測定NNK及其代謝物的系統，還涉及測定吸煙者血液尿液NNK及其代謝物的方法，屬于分析儀器領域。

背景技術

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是卷煙煙氣中一類重要的有害成分，目前已報道的TSNAs有8 種，其中N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝胺基) -1-( 3-吡啶基) -1-丁酮 (NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT) 和N-亞硝基假木賊堿 (NAB) 4 種研究較為深入。尤其是我國國家煙草專賣局將一氧化碳、氰化氫、NNK、氨、 B[a]P、苯酚和巴豆醛7種成分最為表征卷煙煙氣危害性的指標，并對其在卷煙煙氣中的含量作限量控制后，NNK的研究在國內引起了極高的關注。

目前國內NNK的研究主要限于卷煙煙氣中NNK的檢測及降低技術，相關吸煙者血液和尿液中NNK測定及其代謝研究相對較少。NNK的致癌性來源于體內代謝活化過程。NNK發生羰基還原反應生成4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)，NNK和NNAL進一步發生α-羥基化反應，其產物可以與DNA反應生成DNA加合物，呈現致癌活性。因此NNK及其穩定代謝產物NNAL的準確測定對于深入研究吸煙與健康的相關性非常重要。

關于NNK及代謝物NNAL的檢測，文獻報道多采用[5-³H]NNK標記，HPLC 法分析。近年來，HPLC-MS/MS 因其具有較高的靈敏度和選擇性，被廣泛應用于TSNAs及其代謝物的檢測中，尤其是在生物復雜基質中，例如微粒體、尿液、血液等。但吸煙者血液和尿液中的TSNAs及其代謝產物含量極低，仍需要對樣品進行高倍數的富集和干擾物分離后才能測定。目前TSNAs及其代謝產物分析常用的樣品前處理固相萃取或柱層析分離凈化，該類方法凈化樣品需多次的濃縮、轉移，操作繁瑣；而且還會因在敞開環境中大量使用有機溶劑而污染環境，對實驗操作人員的健康危害大。

發明內容

針對上述存在的技術問題，本發明中構建了一種基于固相萃取的液相-液相二維色譜測定NNK及其代謝物的系統和方法。在所述方法中，吸煙者血液和尿液樣品可直接進樣分析，大大簡化了樣品前處理操作步驟，提高了分析結果的精密度；該方法還能顯著減少前處理過程中有機溶劑用量，大大降低了樣品前處理過程中有機溶劑向環境中的散發，從而減少了樣品處理過程中的環境污染。

除非另有說明，本發明所采用的百分數均為重量百分數。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種基于固相萃取的液相-液相二維色譜測定NNK及其代謝物的系統，包括一級色譜系統和二級色譜系統，一級色譜系統與二級色譜系統之間通過六通閥連接；固相萃取柱設于六通閥上；一級色譜系統包括進樣器，進樣器一端與第一泵連接，另一端與凈化柱連接，凈化柱一端檢測器連接，檢測器一端與三通閥一端連接，三通閥的該端還與第二泵連接，三通閥的另外兩端一端為廢液出口，另一端連接混合器；第二泵將NNK和NNAL流出部分餾分切割進入固相萃取富集，其余部分則流入廢液；二級色譜系統的第三泵與六通閥其中一口連通，另一口與二級色譜系統的分析柱連接，分析柱與檢測器連接。

進一步地，六通閥上設有七個口，分別為第一口至第七口，混合器一端與第七口連通，固相萃取柱兩端與第一口和第四口連通。