[發(fā)明專利]一種具有高逆轉(zhuǎn)錄效率的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應用

在審

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• 申請日: 2019-11-13
• 公開（公告）號: CN112795546A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設計）人: 蔣析文;劉靄珊;趙繼光
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12Q1/48
• 代理公司: 上海助之鑫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發(fā)明提供了一種具有高逆轉(zhuǎn)錄效率的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應用，具體地，本發(fā)明構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄酶(M?MLV)突變庫，通過逐步篩選，最終篩選出了熱穩(wěn)定性提高且擴增效率較高的突變體(逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mu_40)。在高溫條件下(58℃)，與野生型相比，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體Mu_40的逆轉(zhuǎn)錄效率提高了46.52倍。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種具有高逆轉(zhuǎn)錄效率的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應用。

背景技術

鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)是一種以RNA為模板的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3’-5’外切酶活性，可用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。由于RNA具有較復雜的二級結(jié)構(gòu)，對M-MLV酶的逆轉(zhuǎn)錄效率影響較大。打開RNA二級結(jié)構(gòu)最簡單的方法是通過高溫使二級結(jié)構(gòu)的氫鍵打開，RNA變?yōu)榫€性單鏈。但野生型的M-MLV酶最適反應溫度為37℃，高溫下穩(wěn)定性下降并且活性降低。因此通過突變使M-MLV酶的熱穩(wěn)定性提高，使其適應高溫下的反應是M-MLV酶的主要改造方向。

M-MLV酶的突變改造有以下的途徑：

1、隨機突變。對M-MLV全長序列或者某一結(jié)構(gòu)域進行隨機突變，然后進行篩選。此方法可篩選出高活性和高熱穩(wěn)定性的MMLV突變體，但技術過程繁復，隨機突變產(chǎn)生的突變庫容量可達到10⁷，伴隨大量的無活性突變，篩選難度極大。(參考文獻：Arezi B,HogrefeH.Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptaseincrease thermostability through tighter binding to template-primer[J].Nucleic Acids Research,2008,37(2):473-481.)

2、對特定活性位點進行定點突變。此方法針對性較強，通過增加核酸結(jié)合位點、金屬離子結(jié)合位點等關鍵活性位點氨基酸與底物的親和力，提高酶活。但此方法缺乏對酶整體結(jié)構(gòu)的分析，不能從整體上提高酶的穩(wěn)定性。(參考文獻：Yasukawa K,Mizuno M,KonishiA,et al.Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virusreverse transcriptase by site-directed mutagenesis[J].Journal ofBiotechnology,2010,150(3):299-306.)

總體而言，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復雜性，不僅是位于活性位點的氨基酸甚至一些遠離活性位點的氨基酸都可能對酶的整體結(jié)構(gòu)及性能產(chǎn)生影響，因此酶的改造存在極大的不確定性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種耐高溫且具有高逆轉(zhuǎn)錄效率的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，所述逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在對應于野生型鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)的氨基酸序列的第221位的氨基酸殘基位點發(fā)生突變，其中，氨基酸殘基編號采用SEQ ID NO.1所示的編號。

在另一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，第221位的氨基酸殘基位點突變?yōu)锳rg。

在另一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的氨基選序列與SEQ ID NO.3相比具有至少約80％的同源性；更優(yōu)選地，具有至少約90％的同源性；最優(yōu)選地，具有至少約95％的同源性；如具有至少約96％、97％、98％、99％的同源性。

在另一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸分子，所述多核苷酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。