[發明專利]一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法

在審

• 申請號: 201911102328.3
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN110747200A
• 公開（公告）日: 2020-02-04
• 發明（設計）人: 鄔曉勇;劉恩澤;孫雁霞;余海萍;王天;吳琪;趙鋼
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C07K14/415;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/02;A61P31/10;C12R1/19
• 代理公司: 11246 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 王學芝

本發明公開了一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，該核苷酸序列為如SED ID NO.5所示，本發明通過原核表達體系表達藜麥抑制白色念珠菌蛋白，表達方法包含：(1)將全基因合成的菌種進行擴大培養，提取質粒，以該質粒為模板，采用PCR擴增引物，進行PCR擴增；(2)將目的片段回收，與PET?30a+載體進行連接，之后進行測序分析；(3)將目的片段與表達載體連接之后轉化大腸桿菌；(4)對目標菌種進行擴大培養，加入IPTG誘導蛋白表達，得到表達蛋白完成的菌液。該方法為藜麥抗白色念珠菌蛋白的大規模生產提供一種更為良好的實際應用途徑。

技術領域

本發明涉及一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，具體涉及一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法。

背景技術

白色念珠菌(Candida albicans)為泌尿系統感染的主要元兇，目前主要的治療手段是達克寧栓和克霉挫栓劑，但是往往治療效果不好，引起反復。更嚴重者需要口服伊曲康唑或者氟康唑等抗真菌藥物。然而，口服對肝臟有嚴重損傷并且真菌容易產生耐藥性，這也是臨床上病情反復的原因之一。

抑制白色念珠菌蛋白是一類病程相關蛋白，主要來源于作物。目前有研究表明，在富含淀粉的籽粒中通常含有對白色念珠菌具有強烈的抑制作用的蛋白。而這一類型蛋白對白色念珠菌的作用屬于物理滲透性，即在適合的條件下依靠物理作用造成白色念珠菌內容物泄露而死亡，因此不會產生耐藥性。

該蛋白對白色念珠菌的作用僅在玉米上有過報道，而在藜麥中尚未有報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，通過構建表達藜麥抑制白色念珠菌蛋白的原核表達體系，為藜麥抑制白色念珠菌蛋白的大規模生產提供一種更為良好的實際應用途徑。

為了達到上述目的，本發明提供了一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR擴增引物，該PCR擴增引物，其上游引物為如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，其下游引物為SEDID NO.2所示的核苷酸序列；或其上游引物為如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，其下游引物為SED ID NO.4所示的核苷酸序列。

本發明還提供了一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，該核苷酸序列為如SED ID NO.5所示。

本發明還提供了一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因編碼的氨基酸序列，該氨基酸序列為如SED ID NO.7所示。

本發明還提供了一種藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因載體的構建方法，該方法包含：

(1)將核苷酸序列為如SED ID NO.5所示的藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因和載體進行連接反應；

(2)將步驟(1)得到的連接產物轉化到CaCl₂感受態細胞中，在轉化后CaCl₂感受態細胞中加入預熱的LB液體培養基，混勻，于恒溫搖床上震蕩培養；

(3)將步驟(2)得到的重組菌種涂布于含有100μg/mL氨芐青霉素的IPTG/X-gal平板上，于恒溫過夜培養，若藍斑不明顯將平板于4℃凍存；

(4)在ITPG/X-gal平板上挑選白色單菌落，將其置于含終濃度為100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養基中，在溫度為37℃條件下振蕩培養，獲得含有藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因的載體菌種。

本發明還提供了一種含有所述的藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列的克隆載體。

優選地，該克隆載體為pET-30a+。

本發明還提供了一種原核生物中表達的藜麥抑制白色念珠菌蛋白基因核苷酸序列，該核苷酸序列為如SED ID NO.6所示。