[發明專利]用于檢測產毒肺炎衣原體的熒光定量PCR方法及相應的試劑盒

在審

• 申請號: 201911099577.1
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN111676300A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 曹亮;張智閔;連政漢;張新帥;王萌萌;王璋;趙亮;郝祎琪;蔣華;束文圣
• 申請（專利權）人: 廣東美格基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/01
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• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種檢測產毒肺炎衣原體熒光定量PCR的方法及試劑盒。本發明巧妙的應用了特異性的基因檢測區分肺炎衣原體屬與其它衣原體屬，以及產毒和非產毒的肺炎衣原體屬，通過綜合判斷，得出準確的菌屬信息。本發明與現有的主流檢測試劑盒相比，本發明用于檢測產毒肺炎衣原體試劑盒具有靈敏度高、快捷方便、特異型好、判斷嚴謹準確等優勢，具有良好的應用前景和市場價值。

技術領域

本發明屬于分子檢測技術領域，具體涉及一種通過特異性基因對產毒肺炎衣原體進行熒光定量PCR的檢測方法及相應的檢測試劑盒。

背景技術

肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)無運動力，能獨立進行有限的代謝活動。肺炎衣原體染色體有DNA和RNA兩種核酸，只能在細胞內復制、繁殖，發育周期分為原體和網狀體兩階段。原體平均直徑為0.38nm，在電鏡下呈梨形，并有清晰的周漿間隙，原體中無質粒DNA。Giemsa染色呈紫色，Macchiavello 染色呈紅色。原體具有高度感染性，在宿主細胞外較為穩定，無繁殖能力。當進入宿主易感細胞后，細胞膜位于原體外形成空泡。原體在空泡中逐漸發育、增大成為始體。根據遺傳性和生物學特性，肺炎衣原體可分為TWAR、考拉和馬肺炎衣原體3個生物變種。

人類肺炎衣原體感染呈世界性流行，不分地域、不受種族和年齡限制。肺炎衣原體TWAR生物變種僅是從人分離到，同時也只有1個血清變種。TWAR 對呼吸系統有致病性，最突出的是引起急性或慢性支氣管炎和肺炎。此外，還與急性或慢性呼吸道疾病如中耳炎、肺阻塞性疾病以及動脈粥樣硬化、哮喘、結節性紅斑、反應性呼吸道疾病、Reiter氏綜合征、肉樣瘤病等有關。

臨床依據肺炎衣原體感染患者的癥狀和體征，很難鑒別細菌性、病毒性、肺炎支原體或肺炎衣原體的感染，以致在臨床用藥上存在困難，一般只能依賴實驗室通過人體體液標本進行病因檢測。常用的微生物學檢查方法包括分離培養和血清學檢測，存在靈敏性差、試驗過程復雜等特點。因此，尋找一種快速、靈敏并且適用于臨床診斷的檢測方法已顯得非常緊要。近年來，豐富的基因組數據為分子診斷技術鎖定肺炎衣原體特異性序列提供了參考數據庫。當前，分子生物學技術正以其高靈敏度、高特異性、實驗周期短、易操作等優勢逐步應用于肺炎衣原體的診斷檢測。

發明內容

本發明旨在克服上述現有技術的至少一種缺陷，提供一種用于檢測產毒肺炎衣原體的熒光定量PCR方法。具體地，上述方法包括如下步驟：

S1、收集樣品；

S2、提取基因組DNA；

S3、檢測肺炎衣原體屬特異性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及產毒特異性基因gene4；

S4、讀取擴增Ct值；當所述肺炎衣原體屬特異性基因中至少1個基因和所述產毒特異性基因的Ct值均小于35時，產毒肺炎衣原體的檢測結果為陽性；當所述肺炎衣原體屬特異性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35 和/或所述產毒特異性基因gene4的Ct值大于35時，產毒肺炎衣原體的檢測結果為陰性。

作為一種優選技術方案，所述肺炎衣原體屬特異性基因rpoB (NCBI AccessionNumber：KT737262.1)的檢測引物如SEQ ID NO：1～2所示：

SEQ ID NO：1(5′-CCCGTGATATCCCCAACGTT-3′)；

SEQ ID NO：2(5′-CACGGACGTTTTGCACACTT-3′)。

所述肺炎衣原體屬特異性基因genel(NCBI Accession Number：VEU56921.1) 的檢測引物如SEQ ID NO：3～4所示：

SEQ ID NO：3(5′-GTGCGAGTGTTTGTGCCATT-3′)；