[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗體的熒光標(biāo)記蛋白芯片制備和檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911097381.9
• 申請(qǐng)日: 2019-11-11
• 公開（公告）號(hào): CN110702925A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周斌;吳月;吳許丹;陳婧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 32218 南京天華專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 徐冬濤;競(jìng)存

1.一種同時(shí)檢測(cè)CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗體的Cy3標(biāo)記蛋白芯片制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

S1：截取CSFV-E2、JEV-EDIII、PRRSV-N基因特異性抗原表位，分別將CSFV-E2、JEV-EDIII、PRRSV-N基因特異性抗原表位、PPV-VP2基因序列，克隆至pET-32a原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E2、pET-32a-EDⅢ、pET-32a-N、pET-32a-VP2；

S2：鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-E2、pET-32a-VP2、pET-32a-EDⅢ、pET-32a-N分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)，離心分離上清和包涵體，對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌、溶解、過濾后用His標(biāo)簽高親和力Ni柱純化，得到目的蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度后-80℃保存；

S3：將S2制得的重組蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV稀釋后，點(diǎn)樣在芯片載體上，所述載體為環(huán)氧基片，經(jīng)水合、干燥、封閉、洗滌制得檢測(cè)CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗體的Cy3標(biāo)記蛋白芯片，儲(chǔ)存?zhèn)溆茫粌?yōu)選的，所述儲(chǔ)存條件為4℃。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，S1中，所述CSFV-E2基因特異性抗原表位為GenBank:FJ598612.1，193-530bp處，JEV-EDIII基因特異性抗原表位為GenBank:LC095865.1，849-1304bp處，PRRSV-N基因特異性抗原表位為GenBank:KM252867.1，1-372bp處，PPV VP2基因序列如SEQ ID No.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，S2中，所述IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2mM，誘導(dǎo)條件為37℃，5h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，S3中，制備的蛋白芯片至少包含一個(gè)檢測(cè)區(qū)，每個(gè)檢測(cè)區(qū)至少包括CSFV蛋白檢測(cè)亞區(qū)、PPV蛋白檢測(cè)亞區(qū)、JEV蛋白檢測(cè)亞區(qū)、PRRSV蛋白檢測(cè)亞區(qū)，2％BSA陰性對(duì)照亞區(qū)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S3中所述稀釋為，將S2制得的重組蛋白CSFV、PPV、JEV、PRRSV分別稀釋至0.025mg/ml-0.4mg/ml；

優(yōu)選的，所述稀釋為將CSFV稀釋至0.2mg/ml，將PPV稀釋至0.4mg/ml，將JEV稀釋至0.4mg/ml，將PRRSV稀釋至0.4mg/ml；

更優(yōu)選的，稀釋所用蛋白稀釋液為含博奧點(diǎn)樣液的PBS；

更進(jìn)一步優(yōu)選的，稀釋所用蛋白稀釋液為含50vol％的博奧點(diǎn)樣液的PBS；

所述點(diǎn)樣方式為晶芯Personal Arrayer 16接觸式點(diǎn)樣系統(tǒng)；

所述水合條件為37℃水合10h以上，優(yōu)選的，水合條件為37℃水合10h；

所述封閉方法為2％BSA封閉2h；

所述洗滌方法為PBST，洗滌5min；

各檢測(cè)樣本間通過凸起的圍欄進(jìn)行隔離。

6.采用權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的同時(shí)檢測(cè)CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗體的Cy3標(biāo)記蛋白芯片檢測(cè)方法制備得到的同時(shí)檢測(cè)CSFV、PPV、JEV、PRRSV抗體的Cy3標(biāo)記蛋白芯片。