[發(fā)明專利]一種低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911091310.8
• 申請日: 2019-11-09
• 公開（公告）號: CN112778412B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖建喜;么林妍
• 申請（專利權(quán)）人: 膠原蛋白（武漢）生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12P21/06;C07K1/14
• 代理公司: 北京力量專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 韓慧穎

本發(fā)明屬于膠原蛋白制備領(lǐng)域，具體涉及一種低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法。本發(fā)明通過在膠原蛋白原料處理環(huán)節(jié)中增加低溫堿溶液處理步驟，在保證膠原蛋白活性不被破壞的前提下，制備獲得低內(nèi)毒素的膠原蛋白，該方法對內(nèi)毒素去除效率高，制備的膠原蛋白內(nèi)毒素含量顯著低于醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(YY 0954?2015)規(guī)定的0.5Eu/mL；并且本發(fā)明提供的方法操作簡單方便，成本低，無需特殊的設(shè)備，即可除去內(nèi)毒素，得到低內(nèi)毒素的膠原蛋白。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于膠原蛋白制備領(lǐng)域，具體涉及一種低內(nèi)毒素膠原蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

膠原蛋白是人體含量最高的蛋白質(zhì)。膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成材料無可比擬的生物活性、生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等優(yōu)點，在組織工程和藥物輸送等領(lǐng)域廣為應(yīng)用。但是在天然膠原蛋白提取制備過程中，若對內(nèi)毒素的去除不徹底，會降低膠原蛋白材料的品質(zhì)，限制膠原蛋白材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前，研究人員通常采用酸溶酶解法制備膠原蛋白，常用的酸為冰醋酸，酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶等。為了使提取獲得的膠原蛋白符合醫(yī)藥應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，必須將提取獲得的膠原蛋白中的內(nèi)毒素含量降低到0.5Eu/mL以下。而常用于去除內(nèi)毒素的方法主要包括陰離子交換色譜法、親和色譜法、分子篩法、液相分離法、吸附法、蒸餾法等。但是，上述方法均存在很多的缺陷，例如：陰離子交換色譜法對于溶液中存在其它帶負電荷物質(zhì)時的去除效果較差；親和色譜法相對成本較高；液相分離法在去除內(nèi)毒素后容易殘留去污劑；吸附法對處理量有一定的限制，不利于大規(guī)模處理，且操作相對繁瑣；蒸餾法的去除效果不佳。

也有一些專利和文獻中報道了采用氫氧化鈉去除反應(yīng)容器或樣品中內(nèi)毒素的技術(shù)方案，例如，中國發(fā)明專利CN201611037916.X提供了一種去除生物制劑原料液以及反應(yīng)金屬杯上內(nèi)毒素的方法，發(fā)明人通過聯(lián)合高溫處理(110-130℃，40-50min)和復(fù)合溶液(0.2-0.5M氯化鈉溶液中逐滴加入0.1M氫氧化鈉溶液，至pH7-8)處理方式，去除生物醫(yī)藥制劑原料液中的內(nèi)毒素，并且，為了提高去除內(nèi)毒素的效率，還需高溫處理(80-100℃)；雖然這種方法可以較好地去除所述發(fā)明中生物制劑原料液中的內(nèi)毒素，但是這種方法需要對原料液進行高溫處理，然后再用含氫氧化鈉的復(fù)合液處理上述原料液，由此導(dǎo)致原料液中殘留大量的鈉離子、氯離子。因此，該方法明顯不適宜用于去除膠原蛋白中的內(nèi)毒素，原因如下：①高溫導(dǎo)致膠原蛋白變性、分解或失活；②研究人員通常采用堿水解法提取動物組織中的膠原肽，堿性處理條件會使膠原蛋白水解為膠原肽，由此可見，堿處理法普遍不能被用于膠原蛋白的提取過程中；③復(fù)合液會使原料液的鹽濃度大幅增加，進而影響膠原蛋白質(zhì)量和穩(wěn)定性，即使采用額外的脫鹽步驟也會使膠原蛋白收率大幅下降。

在中國發(fā)明專利CN201110220654.1中，發(fā)明人采用氫氧化鈉(1.5g/L)處理羥乙基淀粉酸水解液，處理時間0.25-20h，該方法對羥乙基淀粉酸水解液中的內(nèi)毒素的降低效果達到15％-80％，其中最優(yōu)處理條件為1.5g/L終濃度氫氧化鈉，處理時間2h，處理溫度40℃；該技術(shù)方案中需要用鹽酸溶液調(diào)整處理液pH值。該方法也不適宜用于去除膠原蛋白中的內(nèi)毒素，原因如下：①連續(xù)兩步堿處理(真空高濃度(29.5g/L)氫氧化鈉水解處理-超濾-低濃度(1.5g/L)氫氧化鈉處理)的技術(shù)方案，增加了操作難度，并且高濃度堿溶液容易導(dǎo)致膠原蛋白變性、分解或失活；②研究人員通常采用堿水解法提取動物組織中的膠原肽，而堿性處理條件會使膠原蛋白水解為膠原肽，由此可見，堿處理法普遍不能被用于膠原蛋白的提取過程中；③對膠原蛋白酶解液和膠原蛋白產(chǎn)品直接進行堿處理，會影響膠原蛋白質(zhì)量和穩(wěn)定性，使膠原蛋白收率大幅下降；④由該專利說明書記載可知，所述技術(shù)方案對內(nèi)毒素的降低效率最高為80％，也就是說，即使采用該方法，也無法將膠原蛋白中的內(nèi)毒素降低至醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.5Eu/mL以下。

因此，即使背負很高的處理成本，本領(lǐng)域的研究人員目前仍然選擇采用陰離子交換色譜法、親和色譜法、液相分離法等去除內(nèi)毒素，以保證膠原蛋白中的內(nèi)毒素含量符合醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。