[發(fā)明專利]用于檢測甲肝病毒的特異性引物對、試劑盒以及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911089244.0
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110699488A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發(fā)明（設計）人: 戈小琴;王增;蔡芳;于丹;胡雅靈;高強;尹衛(wèi)東
• 申請（專利權）人: 北京科興生物制品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 11758 北京睿陽聯(lián)合知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 郭奧博;楊金賢

本發(fā)明涉及用于檢測甲肝病毒的特異性引物對，進一步提供了利用該引物對檢測甲肝病毒含量的試劑盒和方法。本發(fā)明利用甲肝病毒特異性的引物進行熒光定量PCR檢測，可以簡化操作步驟，縮短檢測時限，節(jié)約生產(chǎn)成本與勞動力成本。本發(fā)明提供的檢測甲肝病毒的方法靈敏度高，線性良好，且特異性強，能夠排除其它病毒的干擾，方便、快捷、準確地檢測出樣品中含有的甲肝病毒拷貝數(shù)，可以最優(yōu)的控制產(chǎn)品的質量和有效性能。

技術領域

本發(fā)明涉及一種用于檢測甲肝病毒的特異性引物對以及利用特異性的引物和探針檢測甲肝病毒含量的方法。

背景技術

甲型肝炎病毒(以下簡稱甲肝病毒)滴度的檢測一般采用細胞培養(yǎng)法(《中國藥典》三部)，即將甲肝病毒液稀釋至一定濃度后接種細胞，置35℃培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，由于甲肝病毒不致細胞發(fā)生典型病變(CPE)，故需收獲后提取甲肝病毒，用酶聯(lián)免疫法檢測，通過將定性與定量結合的方法來檢測甲肝病毒的滴度。

傳統(tǒng)的上述方法檢測甲肝病毒滴度耗時較長，一般為21天以上，且需要涉及到病毒接種、細胞培養(yǎng)、觀察、收獲病毒、ELISA抗原檢測，步驟較繁瑣。熒光定量PCR方法檢測病毒滴度為近幾年來逐漸流行的方法，該方法具有靈敏度高、耗時短、特異性強的優(yōu)點，可快速準確的檢測甲肝病毒的含量。

甲肝病毒的滴度是很多生物類制品生產(chǎn)過程中必須控制的一個質量點，包括預防類疫苗的生產(chǎn)過程中，各個工序段需要檢測甲肝病毒滴度含量；甲肝抗體試劑盒的中抗體的生產(chǎn)過程中也需要進行甲肝病毒滴度的檢測。因此，建立一種快速、靈敏、特異性高的檢測方法對生物制品的研發(fā)生產(chǎn)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有應用接種細胞、收獲病毒聯(lián)合酶聯(lián)免疫方法檢測甲肝病毒抗原含量存在的檢測時間長、檢測步驟繁瑣的不足，提供一種新的甲肝病毒滴度的檢測方法，該方法采用甲肝病毒特異性的引物，能夠針對性的檢測出甲肝病毒的滴度，而其它的病毒不被檢測，該方法操作簡單，可較好的為甲肝病毒類制品的生產(chǎn)過程提供質量控制和產(chǎn)品質量評價，也可作為臨床檢測試劑盒的使用。

為解決上述問題，本發(fā)明提供以下方案：

本發(fā)明首先提供了一對用于檢測甲肝病毒的特異性引物對，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO:1：5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’

SEQ ID NO:2：5’-CCTCCGGCGTTGAATGGTTT-3’

本發(fā)明參考多個甲肝病毒毒株序列，針對不同毒株在共有的特定保守序列位置設計上游引物和下游引物各一條，進行人工合成。采用該引物檢測甲肝病毒滴度，特異性高。

本發(fā)明同時保護所述特異性引物對在制備檢測甲肝病毒的試劑盒中的應用，及其在生物制品質量檢測或臨床樣品檢測中的應用。所述生物制品可以是甲肝疫苗或甲肝抗體。所述臨床樣品可以是臨床患者的血清或糞便。

上述檢測甲肝病毒的特異性引物對可用于熒光定量PCR法檢測甲肝病毒。采用熒光定量PCR法檢測時，可以加入熒光染料進行檢測，也可以將所述特異性引物對與熒光探針配合使用。

本發(fā)明優(yōu)選在上、下游引物之間設計一條探針序列，與所述特異性引物對配合使用。本發(fā)明采用的TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基因連接在探針的5’末端，而淬滅基團則在3'末端。PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切陣解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。

具體而言，本發(fā)明提供與所述特異性引物對配合使用的熒光探針，其核苷酸序列如下所示，SEQ ID NO.3：