[發明專利]畢赤酵母生產重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的方法有效
| 申請號： | 201911088025.0 | 申請日： | 2019-11-08 |
| 公開（公告）號： | CN110747198B | 公開（公告）日： | 2021-04-06 |
| 發明（設計）人： | 錢松;李佳佳 | 申請（專利權）人： | 江蘇創健醫療科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/12 | 分類號： | C12N15/12;C07K14/78;C12N15/81;C07K1/22 |
| 代理公司： | 常州市權航專利代理有限公司 32280 | 代理人： | 黃晶晶 |
| 地址： | 213000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 酵母 生產 重組 膠原 蛋白 方法 | ||
1.一種編碼重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈，其特征在于，所述重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈是由權利要求1所述的核苷酸序列編碼表達獲得。
3.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包含如權利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種重組畢赤酵母菌種，其特征在于，所述重組畢赤酵母菌種的基因組中整合有如權利要求1所述的核苷酸序列，所述重組畢赤酵母菌種基于巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris經過基因工程技術手段構建獲得。
5.如權利要求4所述的重組畢赤酵母菌種，其特征在于所述重組畢赤酵母菌種由下述步驟獲得：
(1)合成如SEQ ID NO.1所示的編碼重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的核苷酸序列；
(2)設計PCR引物，擴增獲取編碼重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的DNA片段 ；
(3)構建重組表達載體；
(4)將制備得到重組表達載體線性化后導入至畢赤酵母中，經篩選獲得陽性克隆，得到重組畢赤酵母菌種。
6.一種生產如權利要求2所述的重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的方法，所述方法包括以下步驟：
(1)培養如權利要求4所述重組畢赤酵母菌種，表達重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈；
(2)分離純化步驟(1)中所表達的重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈：分別使用Strep-tagⅡ標簽親和層析介質、6×His標簽的親和層析介質進行雙親各純化。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中分離純化為先采用Strep-tagⅡ標簽的親和層析介質吸附重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈，再用6×His標簽的親和層析介質吸附重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述表達載體構建時的PCR引物如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
9.如權利要求3所述的表達載體在制備基因工程酵母中的應用。
10.如權利要求4所述重組畢赤酵母菌種在制備重組人源Ⅱ型膠原蛋白單鏈的應用。
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