[發(fā)明專利]肝癌陰離子標(biāo)志物的篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911086160.1
• 申請(qǐng)日: 2019-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN110850072B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張水軍;劉旭東;張嘉凱;溫培豪;王智慧;史曉奕;史冀華;方洪波;曹勝利;胡博文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/574;G01N30/02;G01N30/36;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 鄭州豫開專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41131
• 代理人: 朱俊峰

本發(fā)明公開了一種肝癌陰離子標(biāo)志物的篩選方法，包括以下步驟：第一步，提取待檢樣本中的代謝混合物，備用；第二步，將第一步得到的代謝混合物用液相色譜進(jìn)行分離，分離后的樣品用質(zhì)譜儀鑒定分析，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；第三步，確定代謝混合物中的每種代謝物質(zhì)；第四步，篩選出肝癌樣本與肝硬化樣本之間的顯著性差異代謝物質(zhì)即為肝癌陰離子標(biāo)志物。本發(fā)明首次建立了一種與肝癌診斷相關(guān)陰離子標(biāo)志物的篩選方法，篩選出酮異己酸陰離子、2,4?硝基苯酚陰離子、4?壬基酚陰離子和異丁酸陰離子四個(gè)顯著性差異小分子，為日后肝癌藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和思路，具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種肝癌陰離子標(biāo)志物的篩選方法，還涉及篩選出的肝癌陰離子標(biāo)志物在制備肝癌診斷藥物或診斷試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝細(xì)胞癌（hepatocellular?carcinoma?，即HCC），是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，它是一種全球范圍最常見的惡性腫瘤，尤其是在亞洲、非洲和南部歐洲。全球每年新發(fā)病例數(shù)約65萬，其發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第5位，死亡數(shù)約為60萬，為所有惡性腫瘤的第3位。在我國，肝癌的發(fā)生主要與乙型肝炎相關(guān)，每年的新發(fā)病例占全世界新發(fā)病例的55%左右。

肝癌早期癥狀不明顯，具有進(jìn)展迅速、易早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，在臨床上存在早診困難、預(yù)后效果差的問題。目前，臨床上的肝癌篩查方法是B型超聲顯像（即B超）、腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，即AFP）的血清含量或兩者結(jié)合進(jìn)行篩查。然而，B超很難鑒別小肝癌或肝硬化結(jié)節(jié)，而甲胎蛋白血清水平在診斷肝癌時(shí)存在敏感性和特異性較低的缺陷，單獨(dú)用于確診時(shí)的檢出率一般只有50％—75％左右。現(xiàn)有篩查方法的局限性極大地限制了肝細(xì)胞癌的早期有效診斷，預(yù)警作用有限。對(duì)于肝細(xì)胞癌的早期有效診斷有助于顯著提高患者的生存率，因此，開發(fā)具有臨床早診潛力的新方法對(duì)于降低肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，代謝組學(xué)技術(shù)作為一個(gè)新的有力工具，被廣泛運(yùn)用于疾病研究中。將疾病狀態(tài)下異常的或者數(shù)量變化極大的代謝小分子作為標(biāo)志物，以用于診斷疾病的進(jìn)程具有重要意義。質(zhì)譜技術(shù)是代謝組學(xué)的主要研究手段，其檢測小分子代謝物在疾病診斷中的應(yīng)用已有成功的案例，包括基于檢測多種氨基酸的新生兒疾病篩查、檢測肌氨酸的前列腺癌判別等。但目前還未有關(guān)于小分子代謝物陰離子作為由肝癌篩查相關(guān)的標(biāo)志物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種肝癌陰離子標(biāo)志物的篩選方法，還涉及篩選出的肝癌陰離子標(biāo)志物在制備肝癌診斷藥物或診斷試劑盒中的應(yīng)用，對(duì)肝癌的篩查具有重要意義，為日后肝癌的診斷乃至治療藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)和思路。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種肝癌陰離子標(biāo)志物的篩選方法，包括以下步驟：

第一步，提取待檢樣本中的代謝混合物，備用；所述待檢樣本包括肝癌樣本和肝硬化樣本；

第二步，將第一步得到的代謝混合物用高效液相色譜進(jìn)行分離，分離后的樣本用質(zhì)譜儀鑒定分析，采集代謝混合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；

第三步，將第二步得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成.mzXML格式，采用精確質(zhì)量數(shù)匹配25ppm和二級(jí)譜圖匹配的方式確定代謝混合物中的每種代謝物質(zhì)；

第四步，以變量權(quán)重值1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，用OPLS-DA對(duì)第三步確定的每種代謝物質(zhì)進(jìn)行初步篩選，初篩出肝癌樣本與肝硬化樣本之間的差異代謝物質(zhì)，差異代謝物質(zhì)的變量權(quán)重值1，且差異倍數(shù)2或0.?5；用單變量統(tǒng)計(jì)對(duì)初篩得到的差異代謝物質(zhì)再次篩選，篩選出肝癌樣本與肝硬化樣本之間的顯著性差異代謝物質(zhì)（P值0.05）即為肝癌陰離子標(biāo)志物，即酮異己酸陰離子、2,4-硝基苯酚陰離子、4-壬基酚陰離子和異丁酸陰離子。

優(yōu)選地，第一步中代謝混合物的具體提取方法為：將樣本組織用4℃的PBS溶液清洗兩次后，加入超純水破碎勻漿，渦旋，加入提取液后再次渦旋，低溫超聲提取，沉淀，離心，冷凍干燥得到代謝混合物，將代謝混合物于-80℃下冷凍凍存，備用。