[發明專利]一種酶聯標簽短肽及其應用

有效

• 申請號: 201911080837.0
• 申請日: 2019-11-07
• 公開（公告）號: CN110669109B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 莊敏;孫韋平
• 申請（專利權）人: 上海科技大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K14/00;C07K19/00;G01N33/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 徐俊

本發明公開了一種酶聯標簽短肽，其特征在于，其短肽序列如SEQ ID NO.1?2所示。該短肽可以快速化學合成并且被連接酶PafA催化標記到鄰近蛋白的賴氨酸位點上，從而實現蛋白質的體外標記，獲得具有不同功能和特性的蛋白質。

技術領域

本發明屬于蛋白質表面標記技術領域，具體涉及一種新型的酶聯標簽短肽及其應用。

背景技術

蛋白質的體外標記是一種應用十分廣泛的生物學技術，而利用生物酶來介導蛋白質的修飾相較化學修飾，特異性更佳。蛋白質的酶促修飾可用于創建抗體-藥物偶聯物，引入用于成像目的的熒光基團，檢查蛋白質折疊和相互作用以及研究天然的翻譯后修飾。

常用的蛋白質修飾酶有BirA等，但大部分修飾酶都需要在被標記的蛋白上融合相對應的能被修飾的序列，這給某些應用帶來了困難。例如，在研究過程中使用的抗體蛋白很多情況下是由免疫動物產生，并沒有鑒定序列并衍生出成熟的體外表達系統，無法便捷的進行被標記序列的融合。

PUP-IT(Pupylation-based interaction tagging)利用了細菌中的Pup連接酶PafA，通過將鄰近蛋白標記上小分子蛋白Pup(包含64個氨基酸的小蛋白質)來實現對蛋白質相互作用的捕捉。PUP-IT系統不但能對臨近蛋白進行標記，而且能夠捕捉到蛋白質之間微弱的相互作用。

先前已有報道稱，Pup的C端28個氨基酸足以進行PafA介導的標記，但是當Pup被進一步截短至22個氨基酸時，即使在非常高的濃度下也無法再觸發反應(Liu,Q.；Zheng,J.；Sun,W.；Huo,Y.；Zhang,L.；Hao,P.；Wang,H.；Zhuang,M.,A proximity-tagging system toidentify membrane protein-protei)。PUP-IT系統不依賴于被標記蛋白的改造，然而標記片段遠遠大于已有的蛋白修飾酶系統，有可能會造成被標記蛋白功能的改變。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種酶聯標簽短肽及其應用，該短肽可以快速化學合成并且被連接酶PafA催化標記到鄰近蛋白的賴氨酸位點上，從而實現蛋白質的體外標記，獲得具有不同功能和特性的蛋白質。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種酶聯標簽短肽，其特征在于，其短肽序列如SEQ ID NO.1-2所示。

優選地，所述短肽N端修飾有生物素或熒光團。

本發明還提供了上述酶聯標簽短肽的應用。

優選地，所述應用為PafA介導上述酶聯標簽短肽用來標記抗體。

更優選地，所述應用包括以下步驟：

步驟1：將目的蛋白(PG)與連接酶PafA融合表達，體外純化或轉染到細胞中表達；

步驟2：加入體外合成的生物素標記的酶聯標簽短肽，室溫反應；

步驟3：免疫印跡分析檢測蛋白標記結果。

本法明的新型酶聯標簽短肽(肽4.1)中，E52和R56突變為脯氨酸，可能破壞螺旋結構，從而使肽處于更擴展的構象。反過來，原本面向溶劑側但突變為異亮氨酸的E53可以從α螺旋結構中釋放出來，從而促進酶與肽之間的疏水相互作用。肽4.1是一種新近鑒定的較短的肽，可被PafA酶用于賴氨酸結合。與野生型肽不同，肽4.1不包含任何賴氨酸殘基，因此不會形成不需要的支鏈修飾。

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：

本發明將PUP-IT的底物進行了工程改造，使其更為短小，但又保留了原有活性，這使得蛋白質的體外標記更為容易和有效。

附圖說明