[發(fā)明專利]一種高效可靠的hESC-MSC制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911078125.5
• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN110872574B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉進(jìn)培
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0735;C12N5/077;A61K35/28;A61P37/02
• 代理公司: 太原晉科知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14110
• 代理人: 翟沖燕

本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供一種hESC?MSC的制備方法。第一步改變支持/包被材料，第二步改變培養(yǎng)液體系；胚胎干細(xì)胞hESCs采用基于機(jī)械劃塊鋪板的方法開始分化過程。不僅讓hESC逐漸進(jìn)入到分化模式，而且在分化過程中保持較高的成活率，以達(dá)到更好的分化效率。同時通過對傳代方式的調(diào)整，先劃塊法后消化法，利用hESC和MSC的生長特性進(jìn)行篩選，操作簡便、效果明顯。所獲得的hESC?MSC可抑制CD4⁺T?cell增殖和促進(jìn)CD4⁺Foxp3⁺（Treg）的增加。與臍帶MSCs相當(dāng)或者更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力。有強(qiáng)大的增殖能力。在短時間內(nèi)便可達(dá)到簡便、高效的分化效果，衍生細(xì)胞具有典型的MSC細(xì)胞學(xué)特性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效可靠的hESC-MSC制備方法，尤其涉及一種高純度、高分化潛能的胚胎干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)樣干細(xì)胞、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell, MSC）可從成體分離，廣泛存在于成體動物的多種器官組織中，在特定條件下可以按特定程序分化形成多種功能細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞，從而使相應(yīng)的組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。它最早于1968年由Friedenstein在骨髓中發(fā)現(xiàn)，為一種成纖維狀的貼壁細(xì)胞，并且在體內(nèi)和體外都具有分化為成骨、成軟骨和脂肪細(xì)胞的能力。1991年Caplan將這一類具有共同特征但不同組織來源的細(xì)胞統(tǒng)一命名為間充質(zhì)干細(xì)胞。目前已知幾乎所有成人和新生兒組織，包括骨髓、脂肪組織、牙髓、胎盤、羊水和臍帶等中均可分離出這種形態(tài)特征相似且分化能力不盡相同的細(xì)胞。2006年國際細(xì)胞治療學(xué)會（ISCT）提出的人類間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)一直沿用至今：MSC在體外培養(yǎng)條件下必須貼壁，超過95%的MSC必須表達(dá)表面抗原CD105、CD73和CD90，并且缺乏CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19和HLA-DR，同時該細(xì)胞可體外誘導(dǎo)分化為成骨、成脂和成軟骨細(xì)胞。

MSC及其分泌因子在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)或研究中已表現(xiàn)出了一定的療效，其中包括心肌梗塞、肌萎縮側(cè)索硬化、中風(fēng)、難治性創(chuàng)傷、糖尿病、克羅恩氏病和多發(fā)性硬化癥等等。以“mesenchymal stem cell”作為關(guān)鍵詞在Clinical trials.Gov網(wǎng)站進(jìn)行檢索，可得到近千項(xiàng)相關(guān)臨床研究，但其中進(jìn)行到III期臨床試驗(yàn)的只有55項(xiàng)。盡管通過這些臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，MSC的體內(nèi)注射是安全的，但眾多臨床試驗(yàn)也表明了組織來源的MSC在治療中的不穩(wěn)定性。Galipeau J通過對一項(xiàng)失敗的三期臨床試驗(yàn)進(jìn)行分析指出，細(xì)胞異質(zhì)性和有限的體外擴(kuò)增是導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)療效喪失的關(guān)鍵原因。

人胚胎干細(xì)胞（Human embryonic stem cell, hESC）具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，是一類亞全能干細(xì)胞；無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境中，該細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)、中、外三個胚層幾乎所有的細(xì)胞類型。但是，hESC不可以直接應(yīng)用于細(xì)胞治療，因?yàn)檫@種亞全能性干細(xì)胞經(jīng)過快速生長和不受控制的自發(fā)分化會導(dǎo)致畸胎瘤的產(chǎn)生，因此該類細(xì)胞需進(jìn)行譜系定型分化成下游功能細(xì)胞方可用于移植。國內(nèi)外許多研究小組已證實(shí)從hESC獲得MSC或類MSC細(xì)胞是可行的，從有飼養(yǎng)層誘導(dǎo)分化到無飼養(yǎng)層誘導(dǎo)，再到小分子化合物誘導(dǎo)，方法是多種多樣的，并且在不斷的發(fā)展和更新, 迄今所報道的方法可概括如下。

一、滋養(yǎng)層（Feeder）分化方案是最早提出的hESC-MSC誘導(dǎo)方案。2005年，由Barberi, et al等首次發(fā)現(xiàn)hESC與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的OP9細(xì)胞共培養(yǎng)，所得細(xì)胞通過流式分選出CD73⁺的細(xì)胞群，再將該群細(xì)胞在含有胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)1-2周，即可獲得具有成纖維形態(tài)和免疫表型的細(xì)胞。2007年由Trivedi et al等重復(fù)證實(shí)該方案是可行的。但是這種方案分化效率低，CD73+細(xì)胞群僅有5%左右；分化后的細(xì)胞不能保證100%去除未分化的hESC，從而帶來致瘤性的風(fēng)險；同時，以含有外源遺傳物質(zhì)的小鼠細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，會增加異種病原體感染的風(fēng)險，且無法滿足臨床實(shí)驗(yàn)的要求。