[發明專利]帶有熒光標記的PD-L1膜表面表達細胞模型及其應用

在審

• 申請號: 201911076907.5
• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN110734895A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 王選年;孫國鵬;何海汛;岳鋒;李鵬;張艷芳;朱艷平;郭東光;陳威;李丹;蔣力維
• 申請（專利權）人: 新鄉學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C07K7/08;C07K16/28;C12Q1/02
• 代理公司: 11004 北京中建聯合知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 旦帥男;王靈靈

帶有熒光標記的PD?L1膜表面表達細胞模型及其應用，細胞模型是可表達PD?L1成熟蛋白全長序列的真核宿主細胞，所述真核宿主細胞由構建完成的真核熒光表達載體轉染至293T細胞形成，所述真核熒光表達載體在293T細胞中瞬時表達PD?L1蛋白，并將PD?L1蛋白展示在293T細胞表面，細胞模型在篩選能與PD?L1結合的多肽和抗體中的應用。本發明是將牛Fc γ受體信號肽序列代替原來PD?L1基因上的信號肽，能將PD?L1更高效的錨定在細胞膜上，以便將犬的PD?L1成熟蛋白大量展示在真核細胞膜表面。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體屬于帶有熒光標記的PD-L1膜表面表達細胞模型及其應用。

背景技術

程序性死亡受體1（Programmed death 1，PD-L1，CD279）屬于CD28家族成員，在B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞、樹突狀細胞和單核細胞均有表達，其配體PD-L1（Programmeddeath ligand 1，CD274）屬于B7家族成員，作為PD-L1的主要配體，PD-L1主要表達于腫瘤細胞、淋巴細胞、上皮細胞中。癌癥是致犬死亡的常見病之一，目前治療犬癌癥的方法有手術、化療和放療。除此之外，免疫治療也備受關注，一些針對免疫檢查點分子的藥物的研制取得了成功。在許多臨床試驗中，抗PD-L1抗體顯示出了良好的抗腫瘤活性，特別是針對黑色素瘤、非小細胞肺癌和其他癌癥的臨床治療中顯示了極其顯著的療效。同樣在人體中，抗 PD-1 和抗 PD-L1 抗體已被用于晚期黑色素瘤的治療，并且顯示出良好的療效果。目前日益增多的相關研究結果表明，犬類部分腫瘤的發生機制與人類有著很高的相似性，PD-1及PD-L1這一類免疫檢查點分子阻斷多肽和抗體在治療犬類黑色素瘤、骨肉瘤、血管瘤等方面同樣表現出了極大的應用潛力和價值。

在傳統的阻斷PD-1/PD-L1通路的多肽開發中多利用計算機輔助設計，通過大量計算得出理論上最佳的多肽序列，但在實際操作中卻不盡如人意。在驗證設計多肽與PD-1或PD-L1的結合能力時，多使用PBMC；原核或者真核表達的蛋白作為底物。PBMC細胞膜表面蛋白質分子復雜，即使有結合能力，也無法判斷是否和PD-1或PD-L1蛋白結合。設計的藥物最終還是要應用到動物體內，原核表達的蛋白沒有天然的空間三維結構，真核表達的蛋白雖然有空間三位結構，但是真核細胞表達蛋白的成本高，表達量低。本發明制備了一種高表達PD-L1蛋白的細胞模型用于篩選能和PD-L1蛋白結合的多肽或者抗體。

發明內容

本發明的目的是提供帶有熒光標記的PD-L1膜表面表達細胞模型及其應用，要解決現有技術中不能快速、高效的篩選與PD-L1蛋白結合多肽或抗體的技術問題。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

帶有熒光標記的PD-L1膜表面表達細胞模型，其特征在于：所述細胞模型是可表達PD-L1成熟蛋白全長序列的真核宿主細胞，所述真核宿主細胞由構建完成的真核熒光表達載體轉染至293T細胞形成，所述真核熒光表達載體在293T細胞中瞬時表達PD-L1蛋白，并將PD-L1蛋白展示在293T細胞表面。

進一步優選地，所述真核熒光表達載體為pECFP-Fc-PD-L1重組載體，先由添加Kozak序列和酶切位點的牛Fc γ受體信號肽序列，插入到真核表達載體pECFP-N1的多克隆位點中形成pECFP-Fc重組載體，之后構建T-PD-L1重組載體，將pECFP-Fc重組載體和T-PD-L1重組載體進行酶切酶連形成pECFP-Fc-PD-L1重組載體。

進一步地，所述PD-L1成熟蛋白全長序列位于牛Fc γ受體信號肽序列的下游，并與真核表達載體pECFP-N1中的EYFP蛋白融合表達。

進一步地，所述PD-L1成熟蛋白全長序列是犬PD-L1成熟蛋白全長序列，其DNA序列是如SEQ ID No:1所示序列。

此外，所述pECFP-Fc-PD-L1重組載體DNA完整序列是如SEQ ID No:2所示序列。