[發明專利]特異性識別甲硝唑的ssDNA適配體及其應用

有效

• 申請號: 201911069870.3
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110684773B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 周楠迪;魏昊;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

特異性識別甲硝唑的ssDNA適配體及其應用，屬于生物化學與分子生物學、分析化學和組合化學領域。本發明通過磁珠?SELEX技術，將包含35個隨機核苷酸的ssDNA初始文庫進行PCR擴增后固定在鏈霉親和素修飾的磁珠上，加入甲硝唑將與之有親和力的ssDNA競爭下來，擴增后再投入下一輪篩選。經過十輪篩選及克隆測序獲得39條甲硝唑適配體序列，進一步親和力評估后挑選出ap2、ap19、ap21、ap32四條親和力較高的序列，其中ap32具有親和力高、特異性高、結構穩定等優點被選作最優甲硝唑適配體。本發明為甲硝唑檢測提供了性能優良的識別元件。

技術領域

本發明涉及一種特異性識別甲硝唑的ssDNA適配體及其應用，屬于生物化學與分子生物學、分析化學和組合化學領域。

背景技術

甲硝唑屬于硝基咪唑類抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本結構的抗菌抗原蟲藥物，該藥物也能作為禽類、畜類以及水產養殖的飼料藥物添加劑，并且被廣泛用于預防和控制蜂箱中的蜜蜂微孢子蟲。但研究表明，甲硝唑存在致畸、致癌、致突變的潛在風險和遺傳毒性，不合理使用甲硝唑可能導致可食性動物組織中的藥物殘留，甚至污染水源。1999年，我國農業部發布17號文《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定甲硝唑在所有食品動物可食性組織的最高殘留限量為零。2002年3月，國家開始對此類化合物進行嚴格控制，農牧發[2002]1號文件《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》規定了在食源性動物中禁用甲硝唑和二甲硝咪唑，在中華人民共和國農業行業標準NY?5030-2006無公害食品畜禽飼養獸藥使用準則和NY/T472-2006綠色食品獸藥使用準則中規定，禁止以促生長為目的在所有食品動物中使用甲硝唑、二甲硝唑及其鹽、酯和制劑禁用于所有食品動物促生長。因此，檢測食品動物、飼料及相關產品中甲硝唑的含量，對保障食品質量安全具有重要意義。

目前國內外報道甲硝唑殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、極譜分析法、分光光度法、薄層色譜法、化學發光法、免疫檢測法、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-質譜聯用法、光譜法、伏安法等。儀器分析方法靈敏度高，準確性好，但設備昂貴難以普及，對實驗人員要求較高，對樣品的預處理比較復雜，并且分析費時，難以滿足輕便高效的現場檢測。免疫分析法檢測甲硝唑主要方法是酶聯免疫法。酶聯免疫法是利用結合抗體抗原免疫反應與酶催化反應檢測甲硝唑，通過抗體（抗原）與酶結合形成酶標記復合物，酶標記復合物在相應的底物中催化反應，通過電信號、光信號或肉眼識別達到檢測目的的檢測分析技術。目前市場上已有一些針對甲硝唑殘留檢測的ELISA試劑盒產品，不過價格昂貴，酶標抗體的種類有限，并且由于甲硝唑是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生產與應用存在較多的限制。這些都在很大程度上限制了免疫分析方法在甲硝唑檢測中的應用。

指數富集的配體系統進化技術（systematic?evolution?of?ligands?byexponential?enrichment，簡稱為SELEX）是一種從含有隨機序列的初始文庫中體外篩選能與靶分子特異性結合的核苷酸序列的分子生物學技術，通常具有納摩爾到皮摩爾的親和力。SELEX基本原理是構建人工合成的隨機寡核苷酸文庫，將隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結合的寡核苷酸序列，經反復擴增，多輪篩選，即可得到與靶分子強親和力高特異性的寡核苷酸序列，篩選出的寡核苷酸被稱為適配體。SELEX篩選技術具有靶分子廣，親和力高、特異性高，篩選周期短，可代替抗體的特點。

本發明通過磁珠-SELEX技術，將雙鏈DNA分子中反義鏈的末端修飾生物素，利用鏈霉親和素與生物素之間極高的親和力，使雙鏈DNA結合在磁珠表面，然后再與靶分子孵育，與靶分子有較高親和力的ssDNA被靶分子從互補鏈中競爭性脫離互補鏈和磁珠，通過磁力架將ssDNA和磁珠分離。經過多輪篩選得到與甲硝唑高特異結合的ssDNA適配體序列，并挑選ap2、ap19、ap21、ap32四條具有高度相似的二級結構的ssDNA適配體序列進行解離常數測量，得到最優適配體ap32。本發明為甲硝唑檢測提供了穩定性良好、親和力高、易制備、易修飾和標記的高特異性適配體序列。

發明內容