[發(fā)明專利]枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法及其菌劑的制備方法

在審

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• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110684693A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設計）人: 常興
• 申請（專利權）人: 江蘇黑鉆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N11/14;C12R1/125
• 代理公司: 34158 合肥方舟知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 宋萍

本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法及其菌劑的制備方法，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法的步驟中包含：將枯草芽孢桿菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；將PDA培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌菌株移至種子液培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)；調整種子液培養(yǎng)基中的菌液濃度至10⁹個細胞/mL，作發(fā)酵用一級種子液；將一級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得二級種子液；將二級種子液接種于產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中通入空氣，得到發(fā)酵液。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法可以通過二級種子液直接進入大生產階段，發(fā)酵密度高，生產效率高。

技術領域

本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法及其菌劑的制備方法。

背景技術

芽孢桿菌(Bacillus spp.)是內生芽孢的革蘭氏陽性細菌，是目前生防細菌中研究較多的一類，因其能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子，是理想的生防菌篩選對象。研究表明，目前應用于防治植物病害的芽孢桿菌屬細菌有枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)等。植物根際土壤作為受植物活根影響的土壤微區(qū)，含有大量的微生物，包括真菌、細菌、放線菌、藻類、原生動物等。在植物根際微生物中，細菌生長快，也最常見，并且種類繁多，在土壤營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物質的形成和分解、肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境的改善、植物的生長發(fā)育等方面均起著極其重要的作用，被認為是良好的有益微生物資源庫。近些年來，利用土壤中的有益細菌及其代謝產物防治植物病害更是成為國內外研究的熱點。

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種,廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。該菌單個細胞為(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，著色均勻。無莢膜，有鞭毛，能活動，革蘭氏染色為陽性，芽孢(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時常形成皺壁，為需氧型細菌。可以利用蛋白質、多種糖，分解色氨酸。其中枯草芽孢桿菌在生物防治上很具有潛力，在溫度和通氣等適宜條件下，幼齡細胞中大量形成芽孢。另外，枯草桿菌生長速度快，對營養(yǎng)要求比較低，能高效分泌許多蛋白及代謝產物，且其不會產生毒素，是一種無致病性的安全微生物。在醫(yī)藥衛(wèi)生食品等方面用途很廣。

就目前枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵技術而言，通常需要經過三級種子擴大培養(yǎng)后才能進入大生產階段，發(fā)酵密度低，生產效率低，且保存時間短。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有技術的缺陷，提供一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，它可以通過二級種子液直接進入大生產階段，發(fā)酵密度高，生產效率高。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，方法步驟中包含：

將枯草芽孢桿菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)；

將PDA培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌菌株移至種子液培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)；

調整種子液培養(yǎng)基中的菌液濃度至10⁹個細胞/mL，作發(fā)酵用一級種子液；

將一級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得二級種子液；

將二級種子液接種于產芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中通入空氣，得到發(fā)酵液。

進一步，在無菌條件下用接種環(huán)挑取PDA培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌菌株至種子液培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)。

進一步，振蕩培養(yǎng)的條件為，28℃下以180r/min振蕩培養(yǎng)；

和/或一級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為，發(fā)酵12～18h，并在發(fā)酵培養(yǎng)過程中以140～180r/min的攪拌速度攪拌；