[發明專利]組合利用瓊膠酶制備新瓊二糖的方法、重組宿主細胞及重組宿主細胞與表達載體的應用

有效

• 申請號: 201911069088.1
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110951803B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 朱玥明;閆軍軍;陳朋;曾艷;孫媛霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/12;C12N9/38;C12N9/24;C12N15/56
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 蘇宇歡

本發明公開了一種組合利用內切型和外切型瓊膠酶降解瓊脂或或粗瓊膠(紅藻多糖提取物)獲得高純度新瓊二糖的方法。本發明涉及一種瓊膠酶AgaA和一種雙功能酶AgaB，其中AgaA為內切型瓊膠酶，能夠迅速降解瓊脂或瓊脂糖產生新瓊二糖、四糖和六糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；AgaB為雙功能外切型瓊膠酶，同時具有降解瓊脂糖和紫菜多糖(即硫酸酯化的瓊脂糖)的活性，能夠降解瓊脂或粗瓊膠(紅藻多糖提取物)或其寡糖產生單一產物新瓊二糖，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同時本發明還公開了利用基因工程技術重組表達和制備瓊膠酶的方法。本發明所涉及的制備高純度新瓊二糖的方法及特異性瓊膠酶(或紫菜多糖酶)，在制備瓊膠寡糖領域有著廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于酶工程和基因工程技術領域，具體涉及利用特異性瓊膠酶制備新瓊寡糖的方法，特別是組合使用內切型瓊膠酶和外切型雙功能瓊膠酶制備高純度新瓊二糖的方法。

背景技術

瓊膠又叫瓊脂、洋菜、凍粉、寒天、燕菜等，因其獨特的天然性質和豐富的營養價值被廣泛應用在各大工業領域。瓊膠是從石花菜科和龍須菜科紅藻類細胞壁中提取的水溶性多糖物質，由瓊脂糖和瓊脂膠兩部分組成，其中瓊脂糖是由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-內醚-α-L-半乳糖交替組成的線形鏈狀分子，瓊脂膠成分較復雜主要由長短不一的半乳糖殘基的多糖鏈組成。瓊膠具有良好的穩定性及凝膠性，常被用作微生物培養基、瓊脂糖凝膠電泳、和色譜支持材料，也被認為是一種安全的食品添加劑，用于糖衣、釉料、加工奶酪、果凍糖等。但近年來隨著瓊膠自身應用的局限性，瓊膠寡糖逐漸成為研究熱點。目前降解瓊膠的方法主要有化學法和酶促降解法，盡管化學法成本較低，但存在操作條件難控制、產物不均一、產物分析和回收難等問題，而利用酶解法制備瓊膠寡糖,不僅反應條件溫和，能耗低，而且酶催化具有高效性和專一性，能選擇性地切斷糖苷鍵，可克服化學降解法存在的問題，能實現更高效的寡糖生產。

瓊膠酶是一類能夠催化瓊膠降解為瓊膠寡糖的酶，根據其裂解瓊膠的模式不同可將瓊膠酶分為兩類即α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，其中α-瓊膠酶切割瓊脂糖的α-1,3鍵以產生瓊脂寡糖，β-瓊膠酶切割成β-1,4鍵以產生新瓊寡糖。目前已經報道的文獻中大多都是β-瓊膠酶，且屬于糖苷水解酶家族GH16、GH50、GH86 和GH118家族，其中GH16家族最為豐富，家族中已經超過了3000個功能異質的成員，但關于α-瓊膠酶鮮有報道，只有在以下四種海洋細菌中鑒定出α-瓊膠酶，Thalassomonas sp.LD5、Thalassomonas sp JAMB-A33和Alteromonassp.SH-1 及Alteromonas agalyticus GJ1B。瓊膠酶主要來源于微生物和動物，在浩瀚的海洋生態系統中，豐富的海洋植物、動物、海水及海洋沉積物中都存在有產瓊膠酶的細菌。

相對于瓊脂應用的局限性，瓊膠寡糖更具有多樣的生物活性及巨大的應用價值，在醫藥方面，天然多糖因其粘度高、溶解性低，影響了其在醫藥、動物保健、食品等領域的應用，而不同聚合度的瓊膠寡糖，被證明具有良好的抗腫瘤、抗病毒、增強免疫等藥理作用和生物活性。同樣在食品生產、化工等方面也有廣闊的應用前景。目前運用生物酶法制備瓊膠寡糖的工藝并不完善，大部分挖掘到的瓊膠酶對瓊脂糖降解效率較高，但對瓊脂或者粗瓊膠的降解效率較低。就產物而言，獲得的寡糖產物聚合度也不均一，多以新瓊四糖，六糖，八糖等混合物為主要產物。而不同聚合度的寡糖其生物活性和應用價值也存在很大差異，若不能得到聚合度單一的寡糖對其后續的應用會產生很大的影響。