[發明專利]一種熱穩定的雙功能谷胱甘肽合成酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201911066545.1
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN112779229B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 李志敏;崔向偉
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12P21/02;C07K5/037;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 張民華

本發明公開一種雙功能谷胱甘肽合成酶的突變體，所述突變體為將SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1的氨基酸序列進行重組，和/或對重組體進行定點突變，獲得如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或其突變體。本發明的優點在于：本發明的突變體的熱穩定性都得到了顯著的提高，半衰期t_1/2分別是野生酶10?60倍。最優突變體的半衰期t_1/2是野生酶的163.3倍，比酶活比野生酶提高了24％。與野生酶相比，最優突變體的最適溫度從45℃提高到了50℃。通過酶催化、胞內自組裝全細胞催化以及發酵等試驗證明，最終得到的突變體有效地提高了GSH的產量和合成效率。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及對不同來源的雙功能谷胱甘肽合成酶基因進行DNA重組、定點突變、多位點突變，以及重組突變體在谷胱甘肽生物合成中的應用。

背景技術

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的一種含有巰基的生物活性三肽化合物。在生物體內，谷胱甘肽有著多種重要的生理功能。谷胱甘肽能參與體內氧化還原過程，結合過氧化物及自由基以對抗氧化劑對巰基的破壞,同時還可對抗自由基對重要臟器的損害。此外谷胱甘肽在消除人體自由基，提高人體免疫力，抗衰老，在老人遲緩化的細胞上所發揮的功效比年輕人大，谷胱甘肽對于治療放射線、放射性藥物所引起的白細胞減少等癥狀也都具有非常顯著的效果。

酶法合成谷胱甘肽主要是以L-谷氨酸，甘氨酸，L-半胱氨酸三種氨基酸為前體，在ATP和Mg²⁺以及合適的溫度以及pH條件下，經過酶的催化作用而生成GSH。2005年以來多種來源的雙功能谷胱甘肽合成酶(GshF)相繼被發現，該酶同時具有γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GC)合成酶(γ-GCS)活性和谷胱甘肽合成酶(GS)活性。張星等(J.Biotechnol.2017；(241)：163-169)通過將重組GshF與多聚磷酸激酶相結合，體外組成一種ATP再生系統生產GSH的方式，在45℃條件下反應5h時GSH的積累量達到了28.5mM，基于半胱氨酸的得率達到了81.4％。但是由于酶的活力和穩定性限制，酶法在工業上的大規模實際應用很少。

通過蛋白質工程對酶進行改造，可以有效地改良相關酶的性質。劉等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2019；(103):265-277)以來源于未培養細菌的野生型4-脯氨酸羥化酶為對照，將能夠提高熱穩定性以及活性的一段loop結構替換成四種不同來源的4-脯氨酸羥化酶的loop結構，最終得到一株最優體，酶活提高了2倍；孫等(ProteinExpression Purif.2005；(42):122-130)通過不同來源酶的N端替換，將來自Aspergillusniger的木聚糖酶A(AnxA)的N端替換成來源于Thermomonospora fusca木聚糖酶A(TfxA)的N端得到ATx，相比于初始的兩種木聚糖酶，最終酶的活性分別提高3.6倍和5.4倍。此外，通過對折疊自由能的計算也可以對酶的熱穩定性改造提供一定的理論依據，Yu等(Sci.Rep.2017；(10):1038)通過對ΔΔG的計算，篩選到一些潛在的可以提高酶熱穩定性的突變點，最終通過篩選，酶在60℃的半衰期提高了3倍，比酶活也提高了5倍。

目前在提高酶的熱穩定性和活性等方面有許多方法，對此我們希望通過對雙功能谷胱甘肽合成酶基因進行DNA重組以及定點突變和多點突變，使其在提高酶熱穩定性的同時還能夠保持其優異的催化性能，能夠滿足工業化生產的需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種酶熱穩定性高，同時還能夠保持其優異的催化性能的雙功能谷胱甘肽合成酶的突變體。

本發明的第二個目的在于提供所述雙功能谷胱甘肽合成酶的突變體的應用。

為實現本發明第一個目的，本發明公開以下技術方案：一種雙功能谷胱甘肽合成酶的突變體，其特征在于，所述突變體為將SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1的氨基酸序列進行重組，和/或對重組體進行定點突變，獲得如SEQ ID NO.3所示或其突變體。