[發明專利]長鏈非編碼RNA Gas-5調控miRNA-196a的機制及其應用

在審

• 申請號: 201911065348.8
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110699458A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 王凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 50230 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳炳萍

本發明涉及醫學診斷技術領域，公開了長鏈非編碼RNA Gas?5調控miRNA?196a的機制，還公開了長鏈非編碼RNA Gas?5調控miRNA?196a的機制在診斷及治療食管癌的試劑盒及芯片中的應用。本發明以食管鱗狀細胞癌為模型，研發出了長鏈非編碼RNA Gas?5調控miRNA?196a的具體機制，明確了pri?miRNA?196a上與長鏈非編碼RNA Gas?5的結合位點以及該結合位點干擾miRNA?196a生成的機制，同時明確了長鏈非編碼RNA Gas?5上與DGCR8蛋白的多個結合位點以及這些結合位點干擾miRNA?196a生成的機制，本發明提供的結合位點、結合關系以及競爭關系可用于制備診斷以及治療食管癌的試劑盒及芯片，為診斷和治療食管癌開辟新的途徑。

技術領域

本發明涉及醫學診斷技術領域，具體涉及長鏈非編碼RNA Gas-5調控miRNA-196a的機制及其應用。

背景技術

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發病率和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發地區之一，每年平均病死約15萬人。男多于女，發病年齡多在40歲以上。食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質食物，最后水和唾液也不能咽下。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白質，而是以RNA的形式在多種層面上調控基因的表達。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的，對lncRNA新功能的挖掘也成為現今非編碼RNA研究的熱點之一。長鏈非編碼RNAGas-5是1998年在生長抑制的鼠NIH3T3纖維原細胞中呈高表達而被發現的，在人體中，長鏈非編碼RNAGas-5位于非編碼染色體區1q25.1，為一個剪切的、多聚腺苷化的非蛋白編碼RNA，長鏈非編碼RNAGas-5在多種腫瘤中表達異常，但其在食管癌中的表達及作用還尚未見報道。

miRNA是一類長約22nt的小分子非編碼RNA，miRNA基因通常是在細胞核內由RNA聚合酶II(polII)轉錄生成，最初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha酶的作用下被剪切成約70個核苷酸組成的pre-miRNA，然后由ran-GTP和Exportin-5將pre-miRNA輸送到細胞質中，隨后，另一個核酸酶Dicer酶將其剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中。miRNA-196a位于12號染色體，是Hox家族的上游基因，可以調控HOXA9、HOXB7、HOXC8等基因的表達，在脊椎動物的發育過程中起著非常重要的作用；最近的研究表明miRNA-196a基因的異常表達與多種疾病相關，在正常食管粘膜到食管腺癌的發展過程中，miRNA-196a的表達呈現逐漸增高的趨勢。

目前的研究顯示pre-miRNA主要是由胞核中名為“微處理器復合體(Microprocessor complex)”(Drosha、DGCR8、p68、p72等蛋白)的蛋白剪切pri-miRNA而生成，然后由Exportin-5及ran-GTP將其轉運出核，免遭在核中被降解。Drosha蛋白是一種核蛋白，它由富含脯氨酸的區域以及富含精氨酸和絲氨酸的區域組成的N末端和兩個RNaseIII結構域和一個dsRBD結構域組成，Drosha蛋白必須在DGCR8蛋白的輔助下才能特異性地切割pri-miRNA分子。DGCR8蛋白能夠與pri-miRNA分子中形成發夾結構的堿基結合，幫助Drosha蛋白定位到酶切位點處，即pri-miRNA分子莖部距離位于雙鏈莖部和側翼ssRNA序列之間的連接部位的11bp處。