[發明專利]一種甘薯卷葉病毒的RPA檢測引物及檢測方法和應用

在審

• 申請號: 201911065337.X
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110923358A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 李華偉;邱思鑫;邱永祥;張鴻;李國良;羅文彬;劉中華;許泳清;湯浩;紀榮昌;林趙淼;許國春
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 林燕

本發明公布了一種甘薯卷葉病毒的RPA檢測引物及檢測方法和應用，專用于甘薯卷葉病毒特異性分子檢測；所述檢測引物如下：上游引物F如SEQ ID No:1所示和下游引物R如SEQ ID No:2所示；通過提取感染甘薯卷葉病毒的植株DNA、進行RPA恒溫擴增20min，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，產生一條特異性條帶。本發明針對甘薯卷葉病毒建立的RPA等溫擴增技術具有擴增快速高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優點，為甘薯卷葉病毒早期診斷提供技術依據。

技術領域

本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域，具體涉及一種甘薯卷葉病毒的RPA檢測引物及檢測方法和應用。

背景技術

甘薯是以塊根或秧蔓進行繁殖的無性繁殖作物，常會受到病毒的侵染，病毒侵染甘薯后會繼代相傳，從而影響甘薯的正常生長發育，種質和種性退化。而甘薯卷葉病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)是以粉虱傳播的能侵染甘薯的主要病毒之一，每年在全世界甘薯產區均有發生，給甘薯生產帶來嚴重的危害，發生嚴重導致甘薯絕產，造成巨大的經濟損失。

甘薯卷葉病毒屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員，SPLCV是典型的DNA病毒，由煙粉虱(Bemisia tabaci)以持久方式傳播。SPLCV侵染甘薯后，甘薯植株會出現葉片卷曲，壞死、花葉等癥狀。目前，生產上還沒有特效藥防治病毒病，因此，建立高效、快速、實用的病毒檢測技術，加強對甘薯病毒的監測和診斷，對甘薯病毒病的防控具有重要的意義。

目前檢測雙生病毒的傳統方法和聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)分子檢測方法。傳統的血清學檢測假陽性率較高，PCR檢測方法需要昂貴的專業儀器，且擴增時間較長，不適合野外及基層單位應用。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種快速、靈敏、特異和可視化的檢測技術，該技術采用4條特異引物識別靶序列上6個特異區，利用DNA鏈置換聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下對靶基因擴增，具有便捷、快速、準確等優點，但LAMP在檢測過程中產生氣溶膠，出現假陽性。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification RPA)被認為是可以替代PCR的核酸檢測技術，是英國TwistDx Inc公司于2006年研發的一種核酸等溫擴增技術。近年來RPA廣泛應用于很多病原菌的檢測。Boyle(2014)等在利用RPA技術，開發出一種可以快速、靈敏檢測結核分歧桿菌兩個目標基因的方法。Daher(2014)開發出一種實時RPA檢測方法，其可以檢測孕婦體內是否感染B鏈球菌，檢測時間20min內完成，同時可以實現多重檢測。

RPA與PCR和LAMP檢測技術比較如下：