[發明專利]還原胺化酶、編碼基因、重組載體、重組細胞及其應用

有效

• 申請號: 201911064851.1
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110819601B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 劉平;許國超;郭曼;鄭香玉;陳玄皂;薛佳鈺;倪曄;竇哲;孫澤文
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P13/00;C12P17/12
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 蘇張林

本發明公開了一種還原胺化酶、編碼基因、重組載體、重組細胞及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明的還原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而得到的具有還原胺化酶活性的氨基酸序列。本發明重組表達的可溶性SsRA酶具有表達水平高、酶活力高等優點，可用于高效制備(S)?(4’?氯苯基)?(吡啶?2’?基)?甲胺等目前生物催化難以制備的手性雙芳基仲胺，經濟性高，制備方法簡單，反應條件溫和，低耗能，對環境友好，副反應少，只需一步還原即可完成。

技術領域

本發明涉及一種還原胺化酶、編碼基因、重組載體、重組細胞及其應用， 屬于生物工程技術領域。

背景技術

手性仲胺是一類非常重要的化合物，市售的藥物中有40％含有手性仲胺基 團。由于手性雙芳基仲胺具有兩個芳基，可以衍生獲得更多具有藥用價值的結 構，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲胺(CPMAm)可用于合成抗過敏藥貝 托斯汀。目前，貝托斯汀的合成主要通過(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，主要包 括以下合成工藝：

(1)化學法：以(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)為原料， (S)-[Ru(BINAP)Cl₂]₂(NEt₃)為催化劑，加壓，通氫氣，還原得到(S)-(4-氯苯基)-(吡 啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)(趙志全等.中國醫藥工業雜志.2006.37,726-727)。 以手性BINAL-H為手性還原劑，定向合成單一構型(S)-CPMA。

(2)生物法：2007年，Truppo等篩選發現KRED124可以不對稱還原CPMK 生成(R)-CPMA，ee值為94％(Org.Lett.,2007,9,335–338)；2009年，朱敦明 等發現來源于Sporobolomyces salmonicolor的重組羰基還原酶SsCR不對稱還原 CPMK生成(R)-CPMA，ee值為88％(Org.Lett.,2008,10,525–528)；2016年， 淮陰師范大學許家興等發現Cryptococcus sp.在10％[C₂mim][(MeO)HPO₂]存在 時，產物(S)-CPMA的ee最高可達99％(Chem.Eng.J.,2017,316,919-927)； 2018年，本實驗室對前期篩選得到的醇脫氫酶進行了分子改造，使其還原CPMK 的立體選擇性提高至99.5％(R)及反轉至97.8(S)，并在500mM水平進行 了高效不對稱還原(J.Am.Chem.Soc.,2018,140,12645-12654)。

上述合成方法中，化學法所需貴金屬配位體成本較高、反應條件苛刻，生 物法存在立體選擇性不足、催化效率一般等瓶頸問題，并且均需要將羥基進一 步經胺基衍生化獲得帶有手性胺的終產品。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種還原胺化酶，可催化CPMK的 不對稱還原胺化合成手性CPMAm，實現一步法由前手性酮底物合成手性 雙芳基胺。本發明提供了一種具有優異的不對稱還原胺化活性、底物譜廣、 胺基供體范圍寬、對環境友好的還原胺化酶及其編碼基因，以及含有該基 因的重組表達載體和重組表達轉化體，重組酶的制備方法，以及該重組酶 在制備手性雙芳基仲胺化合物中的應用。

本發明的第一個目的是提供一種還原胺化酶(SsRA)，所述的還原胺化酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列經過取 代、缺失或添加一個或多個氨基酸而得到的具有還原胺化酶活性的氨基酸序列。

進一步地，本發明所述還原胺化酶的制備方法為本領域常規制備方法。所 述制備方法較佳地為：將編碼所述還原胺化酶并且帶有點突變的核酸分子克隆 到重組載體中，將所得重組載體轉化到轉化體中，得到重組表達轉化體，通過 培養所得重組表達轉化體，經鎳柱親和層析分離純化獲得所述蛋白質。