[發(fā)明專(zhuān)利]Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911062021.5
• 申請(qǐng)日: 2019-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110904137A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管清美;牛春東;曹富國(guó);施煥然;陳鵬翔
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/66
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/66;C12Q1/6876;C12N15/11;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/82
• 代理公司: 西安長(zhǎng)和專(zhuān)利代理有限公司 61227
• 代理人: 何畏

1.一種Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法以pK7GWIWG2D(II)或pK2GW7為骨架，兩個(gè)載體分別使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；通過(guò)同源重組技術(shù)將其他Gateway系列載體構(gòu)建入兩個(gè)載體。

2.如權(quán)利要求1所述的Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括：

Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體PKGMYC的構(gòu)建方法將pEarleyGate203的35s-myc-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置換pK7GWIWG2D(II)部分片段形成PKGMYC；

Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體pKCYFP和pKNYFP載體的構(gòu)建方法包括：將pEarleyGate101的35s-attR1-ccdb-attR2-YFP-HA-OCS terminal或pEarleyGate104的35s-YFP-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置換pK2GW7的部分片段，分別形成PKCYFP和PKNYFP。

3.如權(quán)利要求2所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體PKGMYC的構(gòu)建方法具體包括：

(1)設(shè)計(jì)引物；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate203為模板，擴(kuò)增得到片段F1；PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min；

(2)使用SacI-HF和KpnI-HF核酸內(nèi)切酶在37℃培養(yǎng)箱酶切pK7GWIWG2D(II)載體30min；

(3)PCR及酶切完成后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離片段，并使用Thermo Scientific的Gene JET Gel Extraction Kit并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)回收DNA片段；

(4)使用vazyme公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接；37℃反應(yīng)30min；

(5)連接完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DB3.1熱激感受態(tài)，同時(shí)轉(zhuǎn)化TOP10熱激感受態(tài)，檢測(cè)ccdB致死情況；轉(zhuǎn)化完成后涂布于Spec抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；第二天挑取單克隆，并用Spec抗性的LB液體培養(yǎng)基搖菌12h，使用天根質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，并測(cè)序。

4.如權(quán)利要求2所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系統(tǒng)的植物表達(dá)載體pKCYFP和pKNYFP載體的構(gòu)建方法具體包括：

設(shè)計(jì)引物；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate101或pEarleyGate104為模板，分別擴(kuò)增得到片段F2和F3；

使用NEB公司的SacI-HF和PmeI核酸內(nèi)切酶在37℃培養(yǎng)箱酶切pK2GW7載體30min；

PCR及酶切完成后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離片段，并使用Thermo Scientific的GeneJET Gel ExtractionKit回收DNA片段；

將pEarleyGate101為模板的擴(kuò)增片段與pK2GW7酶切片段連接，得到PKCYFP，將pEarleyGate104為模板的擴(kuò)增片段與pK2GW7酶切片段連接，得到PKNYFP；質(zhì)粒提取后，測(cè)序。