[發(fā)明專利]一株生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911058504.8
• 申請(qǐng)日: 2019-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN110713943B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭海巖;劉剛;王興業(yè);韓國英;苗玉和;韓法杰;王紅軍;孫秀麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東仙普愛瑞科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/21;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

本發(fā)明涉及豬干擾素的發(fā)酵生產(chǎn)，具體涉及一株生產(chǎn)豬α?干擾素的工程菌及其應(yīng)用。所述工程菌含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的編碼豬α?干擾素的基因，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2019749。使用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，能夠在不改變發(fā)酵工藝的情況下，使重組豬α?干擾素的產(chǎn)量高達(dá)11.23g/L，在原有基礎(chǔ)上提高了35.09倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及豬干擾素的發(fā)酵生產(chǎn)，具體涉及一株生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國是世界養(yǎng)豬大國，2018年出欄超69382萬頭，每年因病毒性疾病的爆發(fā)，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成上百億元損失。急需尋求一種高效、安全以及無毒副作用的豬病毒性疾病防治新產(chǎn)品。目前市場(chǎng)上使用最多的是豬白細(xì)胞干擾素，由四川世紅生物技術(shù)有限公司通過誘生方法生產(chǎn)，于1997年獲得農(nóng)業(yè)部新獸藥證書[(97)新獸藥證字第01號(hào)]。目前利用大腸桿菌和畢赤酵母成功地表達(dá)出重組干擾素，但是至今在我國未有豬重組干擾素獲得新獸藥證書，也未有進(jìn)口的豬重組干擾素獲得進(jìn)口注冊(cè)證書。

重組豬α-干擾素在宿主菌分泌表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生信號(hào)肽切除不完全、分泌產(chǎn)物表達(dá)不均、高密度發(fā)酵時(shí)表達(dá)產(chǎn)物降解以及糖基化程度偏大、高甘露糖基化等問題，這導(dǎo)致重組豬α-干擾素的產(chǎn)量較低且生產(chǎn)成本較高。因此，有必要篩選出新的重組豬α-干擾素高產(chǎn)菌，從而降低生產(chǎn)成本，減少因病毒性疾病導(dǎo)致的豬養(yǎng)殖業(yè)損失。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)重組豬α-干擾素產(chǎn)量較低且生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一株高產(chǎn)重組豬α-干擾素的工程菌，為重組豬α-干擾素大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

一株生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌，其特征在于：其保藏編號(hào)為CCTCC M 2019749；所述工程菌含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的編碼豬α-干擾素的基因。

上述生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌在制備用于治療豬病毒性疾病的產(chǎn)品中的用途。

一種菌劑，其特征在于：包含上述生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌。

所述菌劑在制備用于治療豬病毒性疾病的產(chǎn)品中的用途。

在一些實(shí)施例中，所述豬病毒性疾病包括高致病性藍(lán)耳病、仔豬病毒性腹瀉和豬口蹄疫。

編碼豬α-干擾素的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一種表達(dá)盒，其特征在于：包含上述基因。

一種載體，其特征在于：包含上述基因或上述表達(dá)盒。

一種重組細(xì)胞，其特征在于：包含上述基因或上述表達(dá)盒或上述載體。

一種生產(chǎn)豬α-干擾素的方法，其特征在于：培養(yǎng)上述生產(chǎn)豬α-干擾素的工程菌或上述重組細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生豬α-干擾素。

我們?cè)贜CBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到山豬α-干擾素蛋白序列，刪除了山豬α-干擾素原有的信號(hào)肽，并對(duì)其具有簡并密碼子的氨基酸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇使用頻率高的密碼子，得到新的重組豬α-干擾素序列。通過基因合成，獲得了新的重組豬α-干擾素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。將新基因插入到分泌型多拷貝pPICZaA表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)染到畢赤酵母中，再采用含有高濃度的博來霉素的平板進(jìn)行篩選，獲得了重組豬α-干擾素分泌能力顯著提高的畢赤酵母菌。

將本發(fā)明篩選的畢赤酵母菌應(yīng)用于重組豬α-干擾素的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，能夠在不改變生產(chǎn)過程，工藝步驟，培養(yǎng)條件的情況下，使微生物發(fā)酵法生產(chǎn)重組豬α-干擾素的能力在原有基礎(chǔ)上提高35.09倍，重組豬α-干擾素的產(chǎn)量高達(dá)11.23g/L，適合重組豬α-干擾素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值和工業(yè)實(shí)用性。