[發明專利]一種光控基因轉錄抑制系統及抑制、構建方法

在審

• 申請號: 201911056029.0
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110628820A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 王漢杰;李佳樺;常津;郝亞鋒;潘惠卓
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 12201 天津市北洋有限責任專利代理事務所
• 代理人: 程小艷

本發明公開一種光控基因轉錄抑制系統及抑制、構建方法。主要是利用CRISPR系統設計不同sgRNA靶向不同的目的基因。通過引入光控轉錄抑制系統，在不同的光照條件下，通過藍光依賴性光響應蛋白cib1和cry2互作驅動HDAC間接作用于靶基因，使其結合至靶基因位點，使組蛋白去乙酰化，基因的轉錄受到抑制，從而實現光控基因轉錄抑制。利用“CRISPR基因靶向?光遺傳基因調控”技術，實現VEGF因子及受體基因的精準靶向；同時利用光遺傳調控技術，根據個體差異，實現VEGF因子及受體分子的動態實時可控調節。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種光控基因轉錄抑制系統及抑制、構建方法。

背景技術

隨著人口老齡化的擴大，老年病問題凸顯，其中常見眼底疾病(如黃斑變性、眼底出血、糖尿病性視網膜病變等)往往導致視力嚴重衰退甚至失明，嚴重影響中老年人生活質量。然而臨床治療上述眼底疾病過程中仍存在著難以解決的缺陷如：1)治療作用“不持久”，2)治療作用“易失控”，3)治療作用“不協同”等，導致臨床治療效果不佳。

目前利用抗VEGF方法治療新生血管性眼底病變，是目前臨床的通用策略。治療過程需反復多次進行，但效果欠佳，無法有效逆轉損傷。這種治療現狀不僅為患者家庭造成沉重經濟負擔，同時容易貽誤眼底病變治療最佳時機，導致不可逆損傷甚至失明，嚴重影響患者生存質量。

針對新生血管性眼底病變難防治臨床現狀，本項目擬將“CRISPR基因靶向技術”與“光遺傳蛋白調控技術”相結合，提出抗VEGF策略高協同治療策略。本項目的總體目標是擬將“CRISPR基因靶向技術”與“光遺傳蛋白調控技術”相結合，構建精準可控納米遞藥新系統，提出抗VEGF策略高協同治療新策略。該策略1)利用CRISPR基因靶向技術，實現對靶基因的長久定位，有效改善治療過程持久性；2)利用光遺傳蛋白調控技術，實現對治療劑量的精準調控，有效改善治療過程可控性；3)利用抗VEGF聯合技術，實現對VEGF因子及受體同時下調，有效改善治療過程協同性。進一步通過體內外細胞動物實驗對該系統性能進行驗證，有效改善上述眼底疾病治療的臨床現狀，最終為臨床提供“持久”、“可控”、“協同”的抗VEGF新策略新方法。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術中的不足，提供一種種光控基因轉錄抑制系統及抑制、構建方法。該系統可以通過CRISPR系統設計不同sgRNA，利用HDAC組蛋白去乙酰化系統對不同的靶基因進行光控轉錄抑制，簡單高效。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種光控基因轉錄抑制系統，包括sgRNA,dCas9-cib1,cry2-HDAC質粒表達載體；

其中，所述sgRNA為基因抑制系統靶向部分，設計不同的sgRNA具有特異的靶向性，能夠招募dCas9酶；

所述cib1和cry2為藍光依賴性光響應蛋白，能夠在488nm藍光的調控下,發生光響應性互作；

所述HDAC是一類蛋白酶,對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮著重要的作用；

該系統在藍光作用下，HDAC結合至靶基因位點，使組蛋白去乙酰化，與帶負電荷的DNA緊密結合，染色質致密卷曲，基因的轉錄受到抑制。

本發明的第二個技術方案是光控基因轉錄抑制系統的構建方法，主要步驟如下：

⑴基因靶向sgRNA質粒表達載體的構建：

以pmU6-gRNA為載體，根據sgRNA設計一對引物，以酶切線性化pmU6-sgRNA質粒，并對酶切后的載體進行回收,將退火配對后的sgRNA堿基與回收后的載體進行連接；

其中，所述sgRNA序列的核苷酸序列為SEQ.No.1；

⑵dCas9-cib1表達質粒的構建：