[發(fā)明專利]檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的引物對(duì)及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911055392.0
• 申請(qǐng)日: 2019-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110607378B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟建玉;楊昌利;張長(zhǎng)禹;趙瑞娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州省煙草科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 貴陽(yáng)中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 張行超

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的引物對(duì)，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：5'ATGGCCGCTAAAGATGTA3'；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：5'TTACATCATTCCGCCCATACC3'。本發(fā)明還公開(kāi)一種用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的方法。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，本發(fā)明檢測(cè)方法不需要大批量飼養(yǎng)昆蟲，節(jié)省勞動(dòng)資源，所得抗性結(jié)果準(zhǔn)確，能反應(yīng)昆蟲抗性個(gè)體出現(xiàn)的頻率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的引物對(duì)及檢測(cè)方法，屬于昆蟲抗藥性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

煙蚜Myzus persicae(Sulzer)屬半翅目Hemiptera蚜科Aphididae，可危害十字花科蔬菜、煙草、辣椒、馬鈴薯等400多種植物，是一種世界性重要害蟲。煙蚜除吸食植株汁液造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降外，還可傳播多種植物病毒，常常造成農(nóng)作物大面積絕收。由于其寄主植物廣泛，可在多種作物上轉(zhuǎn)移危害，一直以來(lái)化學(xué)農(nóng)藥是煙蚜的主要防治措施。

吡蟲啉是近年來(lái)發(fā)展最快的新煙堿類殺蟲劑，能選擇性地抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)后突觸的煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，從而破壞昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，使昆蟲處于極度興奮狀態(tài)，逐漸在麻痹中死亡。無(wú)論從高效還是從持久性上看，吡蟲啉都顯著優(yōu)于其他常規(guī)藥劑，已成為防治煙蚜的首選農(nóng)藥品種。然而，吡蟲啉的長(zhǎng)期使用和濫用，致使煙蚜的抗性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，削弱了防控作用，導(dǎo)致了其更大劑量的使用和濫用，引起了農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等一系列問(wèn)題，成為農(nóng)作物生產(chǎn)過(guò)程中亟待解決的主要問(wèn)題之一。自上個(gè)世紀(jì)九十年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了煙蚜對(duì)吡蟲啉抗性種群的產(chǎn)生和發(fā)展，包括美國(guó)、津巴布韋、日本、法國(guó)、西班牙、歐洲的南部和北部地區(qū)，以及中國(guó)的貴州、云南、河南、山東、福建等地，且在連續(xù)應(yīng)用后，抗性發(fā)展迅速。

目前煙蚜對(duì)吡蟲啉的抗性檢測(cè)主要是通過(guò)傳統(tǒng)的生測(cè)法---浸漬法進(jìn)行：將有一定數(shù)量煙蚜的植物葉片浸在系列濃度藥液中10s，以蒸餾水作為對(duì)照，取出后迅速將葉片上的藥液吸干，用毛筆挑取個(gè)體均一的30頭煙蚜，放置在未接觸過(guò)藥劑的葉片背面，每個(gè)濃度重復(fù)3次。24h后檢查結(jié)果，用DPS等軟件處理數(shù)據(jù)，求出毒力回歸方程和致死中濃度LC₅₀，根據(jù)比較LC₅₀值來(lái)判斷煙蚜的抗性水平。

但是，申請(qǐng)人在經(jīng)過(guò)大量的抗性檢測(cè)方法后發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)煙蚜抗藥性的方法需要大批量人工繁殖試蟲，同時(shí)被測(cè)試蟲的齡期和大小一致，并且測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)，效率較低。

為此，急需發(fā)明一種新型、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的引物對(duì)，以及利用該引物對(duì)對(duì)煙蚜進(jìn)行有關(guān)吡蟲啉抗藥性的檢測(cè)方法，該方法具有檢測(cè)時(shí)間短、所需樣品量少、檢測(cè)效率高等特點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的引物對(duì)，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：5'ATGGCCGCTAAAGATGTA3'；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

即：5'TTACATCATTCCGCCCATACC3'。

本發(fā)明還提供一種用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)檢測(cè)煙蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的方法，包括以下步驟：

S1，提取待檢測(cè)煙蚜樣本RNA；

S2，將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA；

S3，以DNA作為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

S4，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化；

S5，將純化后的目的片段連接到載體；

S6，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)獲取菌液；