[發(fā)明專利]一種造血干細(xì)胞HBB基因修復(fù)的方法及產(chǎn)品

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911055288.1
• 申請(qǐng)日: 2019-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112746071B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳宇軒;楊菲;席在喜;張亮;李大力;劉明耀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué);上海邦耀生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N9/22;C12N5/10;C12N15/90;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 北京君慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11716
• 代理人: 王振南

本發(fā)明公開(kāi)了一種造血干細(xì)胞HBB基因修復(fù)的方法及產(chǎn)品，所述方法利用CRISPR?Cas9基因編輯技術(shù)靶向敲除β?地中海貧血(地貧)中缺失位點(diǎn)密碼子41/42(?TCTT)的技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)并合成能識(shí)別引導(dǎo)Cas9蛋白至目標(biāo)基因靶序列的sgRNA，將其與Cas9蛋白混合電轉(zhuǎn)導(dǎo)入β?地貧密碼子41/42(?TCTT)造血干細(xì)胞中，同時(shí)引入同源重組供體高效修復(fù)該突變位點(diǎn)處氨基酸的正常編碼功能，恢復(fù)β?珠蛋白基因的正常表達(dá)。本發(fā)明利用現(xiàn)有基因編輯技術(shù)編輯輸血依賴型β?地貧密碼子41/42(?TCTT)，修復(fù)效率高，修復(fù)后的患者造血干細(xì)胞在自體移植后可以重建患者血液系統(tǒng)并治療地中海貧血疾病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種造血干細(xì)胞HBB基因修復(fù)的方法及產(chǎn)品。

背景技術(shù)

近年細(xì)菌和古細(xì)菌中一種用來(lái)抵御噬菌體和質(zhì)粒等外源DNA片段入侵的獲得性免疫機(jī)制得到了闡釋。該系統(tǒng)由Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因組成。CRISPR系統(tǒng)的免疫干擾過(guò)程主要包括3個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾。適應(yīng)階段，CRISPR系統(tǒng)會(huì)將來(lái)自噬菌體或質(zhì)粒的DNA短片段整合到前導(dǎo)序列和第一段重復(fù)序列之間，每一次整合都伴隨著重復(fù)序列的復(fù)制，進(jìn)而形成一個(gè)新的重復(fù)-間隔序列單元。表達(dá)階段，CRISPR基因座會(huì)被轉(zhuǎn)錄成一段CRISPR RNA(crRNA)前體(pre-crRNA)，該前體在Cas蛋白和反式編碼小RNA(trans-encoded smallRNA，tracrRNA)的存在下會(huì)在重復(fù)序列處被進(jìn)一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA與Cas蛋白形成Cas/crRNA復(fù)合體。干擾階段，crRNA通過(guò)其與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域引導(dǎo)Cas/crRNA復(fù)合體尋找靶點(diǎn)，并在靶點(diǎn)位置通過(guò)Cas蛋白的核酸酶活性造成靶點(diǎn)位置的雙鏈DNA斷裂，從而使靶標(biāo)DNA失去原有功能。其中與靶點(diǎn)3′端緊鄰的3個(gè)堿基必須是5′-NGG-3′的形式，從而構(gòu)成Cas/crRNA復(fù)合體識(shí)別靶點(diǎn)所需的PAM(protospacer adjacent motif)結(jié)構(gòu)。

CRISPR系統(tǒng)分為I，II，III型三個(gè)家族，其中II型系統(tǒng)僅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的協(xié)助下將pre-crRNA加工成與tracrRNA結(jié)合的成熟crRNA。人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)人工構(gòu)建模擬crRNA：tracrRNA復(fù)合體的單鏈嵌合體引導(dǎo)RNA(guide RNA，又稱sgRNA)，即可有效的介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別和切割，從而為在目標(biāo)物種中利用CRISPR系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行修飾提供了廣闊的前景。

β-地中海貧血是一種常見(jiàn)的由于β-珠蛋白基因(HBB基因)缺陷導(dǎo)致成人血紅蛋白異常的遺傳性疾病，我國(guó)“地貧”基因攜帶者約3000萬(wàn)人，涉及近3000萬(wàn)家庭、1億人口，其中重型和中間型“地貧”患者約30萬(wàn)人。其中，密碼子(Codon)41/42(-TCTT)基因型是我國(guó)“地貧”中最為多見(jiàn)的一種，發(fā)病機(jī)制為HBB基因密碼子41/42(-TCTT)移碼突變?cè)斐砂被峋幋a異常并形成終止密碼子導(dǎo)致蛋白翻譯的提前終止，最終使得HBB基因的功能喪失。目前，中間型和重型患者需要長(zhǎng)期輸血和去鐵治療來(lái)維持生命，唯一根治方式為異體造血干胞移細(xì)植術(shù)，但主要實(shí)施障礙是我國(guó)血液資源的緊缺、異體造血干細(xì)胞配型困難及移植相關(guān)并發(fā)癥等。其中，利用慢病毒載體進(jìn)行基因治療，表現(xiàn)出極大的潛力，但是半隨機(jī)的載體整合方式，具致癌風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)慢病毒中的表達(dá)元件在造血干細(xì)胞長(zhǎng)期歸巢和自我更新的過(guò)程中會(huì)逐漸沉默，使得療效下降，即有可能無(wú)法達(dá)到終身治愈的目的。另外，臨床所需的高濃度、高質(zhì)量的慢病毒對(duì)設(shè)備和技術(shù)的要求極高，因此成本很難降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的臨床方案是非常有必要的。