[發明專利]一種紫外誘變型鹽單胞菌突變株及其誘變方法和應用

有效

• 申請號: 201911050556.0
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110846245B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 朱德銳;田磊;王嶸;高翔;李永臻;沈國平;邢江娃;韓睿
• 申請（專利權）人: 青海大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N13/00;C12P17/12;C12R1/01
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 李樹志;包正云

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種紫外誘變型鹽單胞菌突變株及其誘變方法和應用，本發明是利用紫外線多輪循環照射技術將從柴達木盆地小柴旦鹽湖分離純化獲得的一株產四氫嘧啶的鹽單胞菌菌株進行照射誘變，得到能有效提高菌株Ectoine產量的鹽單胞菌突變株，利用本發明誘變方法得到的突變株Ectoine產量大幅提高(增幅290％)，較母株提高2.9倍，而且成本低、操作簡單、無污染以及對環境不會構成危害，在提高菌株Ectoine產量方面具有很好的發酵生產和工業應用潛力。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種紫外誘變型鹽單胞菌突變株及其誘變方法和應用。

背景技術

Ectoine(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidnecarboxylic acid,C6H10N2O2)即1,4,5,6-四氫-2甲基-4-嘧啶羧酸，是一種氨基酸衍生物。具有增強酶活性、穩定DNA結構及保護蛋白質的功能。Ectoine已被廣泛地應用于消化道疾病、干眼綜合征、過敏性鼻炎、皮膚創傷與保健美容等生物醫學領域，其研發產品涉及消化道藥物、滴眼液、鼻噴劑、皮膚創傷藥及新型生物化妝品等。公告號為CN107417669A的發明專利公開了一種3-(1H-吲唑)-四氫嘧啶-2-酮類Ectoine衍生物制備方法，并發現其在保護心血管功能方面具有極高應用價值。公告號為CN109431870A的發明專利公開了一種含四氫嘧啶護手霜及制備方法，具有手部皮膚皸裂愈合率高、淡化色斑效果明顯及加工工藝簡單等優點。

目前，Ectoine大規模生產主要以微生物發酵為主，模式菌株主要有鹽單胞菌屬(Halomonas)與色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)，如H.elongata(DSM 2581T、1A01717與BK-AG18)和C.salexigens DSM 3043T等。相關研究主要集中于菌株優選和發酵工藝與條件的優化。Ectoine的發酵工藝主要包括實驗室條件下的單批次發酵(試管液體培養、淺層液體培養、搖瓶培養與臺式發酵罐等)，中試或工業級大規模生產(分批發酵罐法、流加發酵罐法與細菌擠奶Bacterial milking技術)等，或采用不同發酵方式聯用，以提高Ectoine產量。針對Ectoine積聚菌株的研究，主要集中在野生菌株的分離篩選、基因工程菌株的構建(生物合成Pathway基因和ectABC操縱子等)、模式菌株代謝流量控制發酵(Metabolicoverflow，包括Carbon-limited fed-batch cultures、Metabolic flux analysis與Metabolic flux distribution)及優化。公告號為CN109182236A的專利通過基因敲除技術，導入Ectoine合成基因，獲得一株產Ectoine大腸桿菌，經過連續發酵20～30h后，Ectoine產量達到2.5～3.5g/L。公告號CN108441460A專利對大腸桿菌基因組進行整合，導入ectABCD基因簇，重構了羥基四氫嘧啶合成途徑，在5L發酵罐發酵培養36～40h后，羥基四氫嘧啶產量達到17～24g/L。公告號CN107142234A專利通過導入ectABC基因，獲得重組谷氨酸棒桿菌，經分批補料發酵發酵72h，Ectoine產量達到12g/L。

以上不同的研究方法，各具優劣，其Ectoine總體產量約提高30～79％。原始菌株的生產能力可通過物理(紫外誘變)或化學(硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯等)突變方式大幅度提高。其中，紫外誘變(UV mutagenesis)是一種經典微生物誘變方法，菌株對誘變因素極具敏感性，且正向突變率高，能有效提高生產菌株的產量。至此，尋找高效的能實際應用于菌株優化的選育方法，為本發明技術的初衷，在此基礎上才能為Ectoine大規模發酵生產提供新的菌源，提高Ectoine的發酵生產效率。

發明內容