[發明專利]一種高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌的構建方法

有效

• 申請號: 201911049349.3
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110656056B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 諸葛斌;馬騰飛;宗紅;陸信曜;任全路
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P5/00;C12R1/72
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌的構建方法，屬于微生物技術領域。本發明選取耐高滲透壓的產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018轉化葡萄糖發酵生產蒎烯。該酵母對蒎烯耐受性可達1g/L，有效克服了蒎烯對宿主生產菌的生長抑制，蒎烯的產量達到0.8mg/L。本發明的制備方法具有操作方便、轉化效率高、生產成本低、工業化應用前景廣等特點。

技術領域

本發明提供了一種高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌的構建方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

蒎烯(pinene)，分子式C10H16，是一種重要的單萜類天然化合物，有α-和β-蒎烯兩種異構體，二者均存在于多種天然精油中，以蒎烯為初始原料合成香料已成為工業合成香料的一個重要組成部分。蒎烯具有特殊的分子結構,是一種供電子體,其可與受電子體等進行自由基交替共聚,形成電荷轉移絡合物,從而合成性能優異的聚合物,擴大了其聚合物的應用范圍。松節油中含有58～65％的α-蒎烯和30％的β-蒎烯，其二聚體具有與戰術燃料JP-10相當的高體積能量，可作為現有噴氣機燃料(如戰術燃料JP-10和降冰片二烯二聚體的混合物RJ-5)的替代燃料。除此之外,蒎烯單體還具抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗抑郁和鎮痛等功效，可作為多種藥物的主要藥理活性物,例如人們常用的治療支氣管炎的桉檸蒎腸溶膠囊。

目前蒎烯主要通過化學法合成，即采用高效精餾塔從脂松節油或粗硫酸鹽松節油中進行分離提取。這種方法對設備要求較高，分離提取難度大、成本高，同時造成了大量自然資源的破壞。隨著代謝工程和合成生物學的迅速發展，綠色可持續發展的微生物合成技術為先進生物燃料的制造提供了替代策略，即可利用大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等遺傳背景清晰、基因操作體系成熟的模式微生物實現目標產品的高效合成。與大腸桿菌相比，釀酒酵母由于擁有更強大的蛋白表達和翻譯后修飾系統以及完整的內膜系統，更適于蒎烯合成代謝過程中關鍵酶細胞色素P450蛋白的表達。但是，現有研究表明，200mg/L蒎烯使得釀酒酵母生物量降低75％，其較差的蒎烯耐受性會嚴重影響蒎烯的發酵生產。

產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018是我國擁有自主知識產權的一株具有優良發酵性能的工業菌株，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高滲透壓培養基上正常生長繁殖，具有耐高滲和高抗逆性的特點。

發明內容

針對現有的技術難點及存在的問題，本發明提供了一種以耐高滲透壓的產甘油假絲酵母為生產菌株生產蒎烯的方法，本發明所選耐高滲透壓的產甘油假絲酵母菌株可利用20g/L的葡萄糖在1g/L蒎烯濃度下生成0.8mg/L的蒎烯。

本發明的第一個目的是提供一種高濃度蒎烯耐受性產蒎烯的工程菌。所述工程菌以產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018為宿主，將人工合成的來源于Pinus taeda的蒎烯合酶基因整合到宿主中，構建高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述蒎烯合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述蒎烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明的第二個目的是提供一種高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌的構建方法，所述方法是將SEQ ID NO.1整合到產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M93018基因組中。

在本發明的一種實施方式中，高濃度蒎烯耐受性產蒎烯工程菌的構建方法包括如下步驟：

(1)將SEQ ID NO.1采用BamHI和KpnI連接到pURGAPU質粒上構建重組表達載體，采用SacI線性化重組表達載體；