[發(fā)明專利]一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動子及利用該啟動子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體

在審

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• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110684771A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃義德;林堯;張亞菲;洪文柄
• 申請（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 35211 福州君誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 林月萍

本發(fā)明公開了一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動子及利用該啟動子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體。所述啟動子為FDH1基因啟動子，所述FDH1基因啟動子的序列如SEQ ID NO:1所示。利用FDH1基因啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母表達(dá)載體包括胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌型表達(dá)兩種。本發(fā)明獲得的FDH1基因啟動子以及所構(gòu)建的表達(dá)載體可以有效的提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，同時可以滿足更多啟動子的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動子及利用該啟動子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體。

背景技術(shù)

畢赤酵母由于具有生長快速、可高密度發(fā)酵、遺傳操作簡單和能進(jìn)行翻譯后修飾等特點，現(xiàn)已成為重要的工業(yè)微生物。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)從1993年投入商業(yè)化使用以來，到目前為止表達(dá)的外源蛋白已超過1000多種。畢赤酵母全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序完成后，不僅使其作為外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)上得到更加完善，而且也逐漸成為合成生物學(xué)和代謝工程研究和應(yīng)用的一個重要平臺。

無論是將畢赤酵母作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng)，還是將畢赤酵母作為細(xì)胞工廠用于合成生物學(xué)或代謝工程，均要求有強(qiáng)的啟動子來驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。特別是將畢赤酵母作為細(xì)胞工廠用于合成生物學(xué)或代謝工程研究，涉及合成通路中多基因的共表達(dá)，要求有更多的啟動子啟動多個基因的表達(dá)。目前商用的啟動子中用得最多的是AOX1啟動子。AOX1啟動子為誘導(dǎo)型啟動子，誘導(dǎo)物為甲醇。該啟動子受到甘油和葡萄糖的嚴(yán)格抑制。一般地，在菌體生長期，利用含甘油或葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)要進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時通過離心(搖瓶培養(yǎng))去除原生長培養(yǎng)基，并更換成含甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。或是等培養(yǎng)基中甘油或葡萄糖消耗完后(發(fā)酵罐培養(yǎng))再加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。AOX1啟動子的誘導(dǎo)方式不能在生長培養(yǎng)基中直接增加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，給外源蛋白的表達(dá)增加了染菌的機(jī)會和工序上的麻煩。

本發(fā)明嘗試開發(fā)新的高效不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動子和構(gòu)建可用于外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的載體，更加方便用于畢赤酵母表達(dá)外源蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對以上存在的問題和不足，提供一種全新的不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動子——FDH1基因啟動子，并構(gòu)建了基于FDH1基因啟動子驅(qū)動的表達(dá)載體，該表達(dá)載體可以讓外源基因在畢赤酵母中高效誘導(dǎo)表達(dá)，適合于畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)或作為細(xì)胞工廠表達(dá)外源基因。

為了解決上述目的，本發(fā)明的第一方面，從畢赤酵母中分離得到FDH1基因啟動子，該啟動子序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明第二方面，是提供了一種含所述啟動子序列的表達(dá)載體，利用本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體可以在畢赤酵母中高效誘導(dǎo)表達(dá)外源基因。所述的表達(dá)載體分為胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌型表達(dá)兩種。

較佳地，將所述的SEQ ID NO:1序列與通過Bgl II和EcoR I限制酶雙酶切去除GAP啟動子的載體pGAPZ A連接構(gòu)建成表達(dá)載體pFDH1P，該載體可用于在畢赤酵母細(xì)胞中胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。

較佳地，將所述的SEQ ID NO:1序列與通過Sac I和BamH I限制酶雙酶切去除AOX1啟動子的載體pPIC9K連接構(gòu)建成表達(dá)載體pFDH1Pα，該載體可用于在畢赤酵母細(xì)胞中胞外誘導(dǎo)分泌表達(dá)外源蛋白。

本發(fā)明成功的獲得了FDH1基因啟動子并構(gòu)建了該基因啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母表達(dá)載體。實驗證明，與AOX1啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體相比，本發(fā)明所構(gòu)建的FDH1基因啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄的胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體，表達(dá)量均高出AOX1啟動子20％。同時，該胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體可以不受甘油和葡萄糖抑制進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

因此，本發(fā)明獲得的FDH1基因啟動子以及所構(gòu)建的表達(dá)載體可以有效的提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，同時還可以在生長培養(yǎng)后無需更換培養(yǎng)基直接進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。

附圖說明