[發(fā)明專利]一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子及利用該啟動(dòng)子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911045712.4
• 申請(qǐng)日: 2019-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN110684771A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃義德;林堯;張亞菲;洪文柄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 35211 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 林月萍

本發(fā)明公開了一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子及利用該啟動(dòng)子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體。所述啟動(dòng)子為FDH1基因啟動(dòng)子，所述FDH1基因啟動(dòng)子的序列如SEQ ID NO:1所示。利用FDH1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母表達(dá)載體包括胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌型表達(dá)兩種。本發(fā)明獲得的FDH1基因啟動(dòng)子以及所構(gòu)建的表達(dá)載體可以有效的提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，同時(shí)可以滿足更多啟動(dòng)子的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子及利用該啟動(dòng)子構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體。

背景技術(shù)

畢赤酵母由于具有生長(zhǎng)快速、可高密度發(fā)酵、遺傳操作簡(jiǎn)單和能進(jìn)行翻譯后修飾等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為重要的工業(yè)微生物。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)從1993年投入商業(yè)化使用以來(lái)，到目前為止表達(dá)的外源蛋白已超過(guò)1000多種。畢赤酵母全基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序完成后，不僅使其作為外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)上得到更加完善，而且也逐漸成為合成生物學(xué)和代謝工程研究和應(yīng)用的一個(gè)重要平臺(tái)。

無(wú)論是將畢赤酵母作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng)，還是將畢赤酵母作為細(xì)胞工廠用于合成生物學(xué)或代謝工程，均要求有強(qiáng)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。特別是將畢赤酵母作為細(xì)胞工廠用于合成生物學(xué)或代謝工程研究，涉及合成通路中多基因的共表達(dá)，要求有更多的啟動(dòng)子啟動(dòng)多個(gè)基因的表達(dá)。目前商用的啟動(dòng)子中用得最多的是AOX1啟動(dòng)子。AOX1啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)物為甲醇。該啟動(dòng)子受到甘油和葡萄糖的嚴(yán)格抑制。一般地，在菌體生長(zhǎng)期，利用含甘油或葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)要進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)通過(guò)離心(搖瓶培養(yǎng))去除原生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并更換成含甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。或是等培養(yǎng)基中甘油或葡萄糖消耗完后(發(fā)酵罐培養(yǎng))再加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。AOX1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)方式不能在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中直接增加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，給外源蛋白的表達(dá)增加了染菌的機(jī)會(huì)和工序上的麻煩。

本發(fā)明嘗試開發(fā)新的高效不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和構(gòu)建可用于外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的載體，更加方便用于畢赤酵母表達(dá)外源蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)以上存在的問(wèn)題和不足，提供一種全新的不受甘油和葡萄糖抑制的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子——FDH1基因啟動(dòng)子，并構(gòu)建了基于FDH1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，該表達(dá)載體可以讓外源基因在畢赤酵母中高效誘導(dǎo)表達(dá)，適合于畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)或作為細(xì)胞工廠表達(dá)外源基因。

為了解決上述目的，本發(fā)明的第一方面，從畢赤酵母中分離得到FDH1基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明第二方面，是提供了一種含所述啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體，利用本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體可以在畢赤酵母中高效誘導(dǎo)表達(dá)外源基因。所述的表達(dá)載體分為胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌型表達(dá)兩種。

較佳地，將所述的SEQ ID NO:1序列與通過(guò)Bgl II和EcoR I限制酶雙酶切去除GAP啟動(dòng)子的載體pGAPZ A連接構(gòu)建成表達(dá)載體pFDH1P，該載體可用于在畢赤酵母細(xì)胞中胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。

較佳地，將所述的SEQ ID NO:1序列與通過(guò)Sac I和BamH I限制酶雙酶切去除AOX1啟動(dòng)子的載體pPIC9K連接構(gòu)建成表達(dá)載體pFDH1Pα，該載體可用于在畢赤酵母細(xì)胞中胞外誘導(dǎo)分泌表達(dá)外源蛋白。

本發(fā)明成功的獲得了FDH1基因啟動(dòng)子并構(gòu)建了該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的畢赤酵母表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)證明，與AOX1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體相比，本發(fā)明所構(gòu)建的FDH1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄的胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體，表達(dá)量均高出AOX1啟動(dòng)子20％。同時(shí)，該胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體可以不受甘油和葡萄糖抑制進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

因此，本發(fā)明獲得的FDH1基因啟動(dòng)子以及所構(gòu)建的表達(dá)載體可以有效的提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，同時(shí)還可以在生長(zhǎng)培養(yǎng)后無(wú)需更換培養(yǎng)基直接進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。

附圖說(shuō)明