[發明專利]用于腫瘤浸潤性淋巴細胞快速培養的飼養細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201911044963.0
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110643574A
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 肖占剛;趙曰水;俞靜;文慶蓮;李靜
• 申請（專利權）人: 西南醫科大學
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N15/01
• 代理公司: 51229 成都正華專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 郭艷艷

本發明公開了一種用于腫瘤浸潤性淋巴細胞快速培養的飼養細胞的制備方法，本發明所用技術為利用絲裂霉素C來處理外周血淋巴細胞得到飼養細胞，然后用飼養細胞與預培養的腫瘤浸潤性淋巴細胞進行共培養。采用本發明的方法制作的飼養細胞擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞的效率與利用γ射線照射制作的飼養細胞擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞的效率相比效果更好，同時利用此法的成本顯著降低。本發明方法制備方法簡單易行，可以廣泛推廣應用。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，尤其涉及一種用于腫瘤浸潤性淋巴細胞快速培養的飼養細胞的制備方法。

背景技術

腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrated lymphocytes,TIL)是離開血液循環，遷移到腫瘤附近的淋巴細胞，它們包括T細胞，B細胞，NK細胞等。它們可以起到殺傷癌細胞的作用。腫瘤中TIL的多少是預測癌癥患者預后和對免疫療法反應的重要指標。TIL療法主要是將從患者新鮮腫瘤組織中分離的TIL在體外細胞的培養環境下進行快速擴增，將TIL的數目擴增到可以給患者進行回輸的數量后再回輸到病人體內。

目前已知的TIL體外擴增的技術用的是將分離的TIL體外進行預培養1-2周以后按照一定比例(通常為1:200)與經30-50Gyγ射線照射過的外周血淋巴細胞(PeripheralBlood Mononuclear Cells,PBMC)進行共培養，主要原理是利用γ射線照射PBMC，使其生長抑制后成為飼養細胞，在與TIL共培養的過程中，飼養細胞分泌的生長因子將促進TIL的快速增殖以達到治療所用的細胞數量。但是這種方法需要專門的照射設備，并且照射成本比較高，而一般的研究機構并不具備此種設備，所以利用此方法進行大量體外擴增TIL對于一般研究機構來說不經濟實惠。

發明內容

本發明的目的在于：針對現有技術中利用γ射線照射PBMC制備飼養細胞，照射成本高，不利于廣泛使用的問題，提供一種用于腫瘤浸潤性淋巴細胞快速培養的飼養細胞的低成本制備方法。

本發明采用的技術方案如下：

一種用于腫瘤浸潤性淋巴細胞快速培養的飼養細胞的制備方法，包括以下步驟：

S1.飼養細胞的制備

1)外周血淋巴細胞的分離與培養：抽取非小細胞肺癌病人自體外周血，用磷酸鹽緩沖液稀釋后加入淋巴細胞分離液進行淋巴細胞的分離，然后用無血清的X-VIVO培養基在5％CO₂、37℃培養箱進行培養；

2)飼養細胞制備：過夜培養后將上述分離后的淋巴細胞進行細胞計數，調整細胞密度為1.5×10⁶cells/mL,加入絲裂霉素C處理1.5-2小時，離心，棄上清液，然后用X-VIVO培養基重懸浮和洗滌細胞，再離心，棄上清液，加入培養基重懸浮細胞，得到飼養細胞；

S2.腫瘤浸潤性淋巴細胞的分離與預培養

將臨床收集的非小細胞肺癌組織用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗后切成1-2mm³的組織塊，然后加入腫瘤浸潤性淋巴細胞培養基,放入5％CO₂、37℃培養箱培養2-3天后棄組織塊，腫瘤浸潤性淋巴細胞繼續培養，每隔2-3天添加新鮮培養基，培養10-14天后，收集細胞，離心后，棄上清液，然后用培養基重懸浮和洗滌細胞，得到預培養的腫瘤浸潤性淋巴細胞；

S3.飼養細胞與腫瘤浸潤性淋巴細胞的共培養

將S1制得的飼養細胞與S2制得的預培養的腫瘤浸潤性淋巴細胞分別離心后，用培養基重懸浮及洗滌兩次，然后加入AIM-V/TIL培養基中，同時添加IL-2及CD3/CD28抗體，放入5％CO₂、37℃培養箱進行培養，每隔2-3天添加新鮮培養基。