[發(fā)明專利]一種還原氧化石墨烯膜在冷凍電鏡中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911043802.X
• 申請(qǐng)日: 2019-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111912869A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王宏偉;陳亞楠;劉楠;徐潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N23/2005
• 分類號(hào): G01N23/2005;G01N23/20058;G01N23/04;G01N23/044;C01B32/198
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 王春霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種還原氧化石墨烯膜在冷凍電鏡中的應(yīng)用。所述還原氧化石墨烯作為或用于制備生物冷凍電鏡載網(wǎng)支持膜。所述還原氧化石墨烯按照包括如下步驟的方法制備：將氧化石墨烯轉(zhuǎn)移至電鏡載網(wǎng)上，經(jīng)還原即得。由于目前支持膜的缺陷，冷凍樣品的制作一直是一個(gè)大的挑戰(zhàn)。尋找一種更穩(wěn)定、導(dǎo)電性更高、背景噪音更低的支持膜是當(dāng)前樣品制作方面的工作重點(diǎn)。而還原氧化石墨烯是目前最符合實(shí)際應(yīng)用的支持膜，解決了以往支持膜缺陷的同時(shí)，又存在自身其他一些諸如超高的機(jī)械強(qiáng)度等特性。可以預(yù)見(jiàn)，單層還原氧化石墨烯載網(wǎng)能夠大規(guī)模生產(chǎn)，能夠給冷凍電鏡的制樣以及后期三維重構(gòu)帶來(lái)極大便利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種還原氧化石墨烯膜在冷凍電鏡中的應(yīng)用，屬于生物冷凍電鏡技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

冷凍電鏡技術(shù)長(zhǎng)期的發(fā)展，尤其是近幾年在數(shù)據(jù)處理和相機(jī)硬件方面接連取得的突破性的進(jìn)展，使得該方法突破了以往分辨率的局限性，近原子分辨率的結(jié)構(gòu)解析變得較為普遍。該技術(shù)將處于生理?xiàng)l件下的溶于水中的樣品快速冷凍，使得樣品保存于非晶玻璃態(tài)的冰中。再用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察并收集照片。最后結(jié)合相關(guān)算法以及圖像處理技術(shù)對(duì)分子進(jìn)行三維重構(gòu)。之前，由于不能達(dá)到很高的分辨率，該方法應(yīng)用不廣。近二十年來(lái)，直接電子探測(cè)相機(jī)的發(fā)明以及相關(guān)算法的優(yōu)化基本上解決了這個(gè)問(wèn)題，使得冷凍電鏡能夠達(dá)到近原子分辨率。冷凍電鏡革命性的突破使其獲得了蓬勃的發(fā)展。我國(guó)也抓住了這次機(jī)遇，應(yīng)用該技術(shù)取得了一系列成績(jī)，并在冷凍電鏡領(lǐng)域占據(jù)一席之地。

經(jīng)過(guò)近幾年的應(yīng)用和發(fā)展，冷凍電鏡技術(shù)后期圖像收集和處理已經(jīng)較為成熟。然而，冷凍樣品制作的技術(shù)發(fā)展，相對(duì)來(lái)說(shuō)收效甚微。直至今天，樣品的可重復(fù)性仍然不高，制作樣品的條件仍需要根據(jù)不同樣品不斷去摸索。良好的冷凍樣品需要非晶玻璃態(tài)冰的厚度適宜、生物大分子分布均勻并且處于非變性狀態(tài)。由于后期圖像處理技術(shù)的成熟，前期樣品制作的問(wèn)題逐漸凸顯。一個(gè)良好的樣品，往往成為得到高分辨率結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。

應(yīng)用于冷凍電鏡樣品制備的樣品支撐載網(wǎng)上一般覆蓋一層多孔碳膜，如果沒(méi)有另外覆蓋支持膜，孔中的大部分樣品會(huì)存在于氣液界面，而存在于氣液界面的生物大分子往往會(huì)產(chǎn)生變性進(jìn)而影響結(jié)構(gòu)。多孔碳膜表面性質(zhì)不均勻、導(dǎo)電性不佳并且機(jī)械剛性不強(qiáng)。導(dǎo)電性不佳會(huì)造成生物大分子在拍照時(shí)產(chǎn)生漂移進(jìn)而影響最終結(jié)構(gòu)的分辨率。通常情況下，為了解決這些問(wèn)題，研究人員會(huì)在多孔碳膜上鋪制一層無(wú)定形超薄碳膜。然而，這層無(wú)定型碳膜會(huì)帶來(lái)較大的背景噪音，對(duì)后期圖像處理帶來(lái)極大困擾。近年來(lái)，也有課題組在嘗試采用氮化硅或者金等材料作為支持膜。然而由于存在導(dǎo)電性差、在液氮溫度下剛性差、制備工藝不成熟等問(wèn)題，這些載網(wǎng)并沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)人們考慮一種背景很小的二維材料—石墨烯作為支持膜。石墨烯很薄，電子能夠輕易穿過(guò)。此外，石墨烯超高的導(dǎo)電性和機(jī)械強(qiáng)度使得它成為一種理想的載網(wǎng)材料。然而，由于石墨烯的疏水性，生物大分子不易附著。有一種方法是將石墨烯氧化，氧化后的石墨烯具有親水性，可以與生物大分子結(jié)合。然而，這降低了石墨烯的導(dǎo)電性，導(dǎo)電性降低會(huì)帶來(lái)一系列困擾。此外，氧化石墨烯表面具有很多官能團(tuán)，使得石墨烯膜厚度增加，背景噪音較強(qiáng)。因此，需要提供一種理想的新型冷凍電鏡載網(wǎng)支持膜材料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種還原氧化石墨烯膜(負(fù)載于電鏡載網(wǎng)上)在生物冷凍電鏡中的應(yīng)用。

由于石墨烯超強(qiáng)的導(dǎo)電性和機(jī)械性能、均勻性以及超薄的特性，可以部分甚至完全消除目前電鏡載網(wǎng)存在的背景噪音強(qiáng)、導(dǎo)電性差、大分子分布于氣液界面等問(wèn)題。由于氧化石墨烯雖然解決了石墨烯疏水的特性，但是降低了導(dǎo)電性，而還原之后可以補(bǔ)償降低的導(dǎo)電性。此外，氧化石墨烯層與層之間存在較多官能團(tuán)，層間距較大，而還原之后層間距減小，因此噪音相對(duì)更小。因此還原氧化石墨烯可作為生物冷凍電鏡載網(wǎng)支持膜。

本發(fā)明采用的還原氧化石墨烯按照包括如下步驟的方法制備：

將氧化石墨烯轉(zhuǎn)移至電鏡載網(wǎng)上，經(jīng)還原即得。

其中，所述氧化石墨烯可采用改進(jìn)的Hummers法制備，具體可包括如下步驟：