[發明專利]一種調控大腸桿菌細胞大小的方法

有效

• 申請號: 201911038423.1
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110656121B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 劉立明;郭亮;陳修來;刁文文;劉佳;羅秋玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/67;C12N15/62;C07K19/00;C12P7/625
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種調控大腸桿菌細胞大小的方法，屬于生物工程技術領域。本發明通過缺失碳儲存調節因子的編碼基因csrA和過表達組氨酸類似物與綠色熒光蛋白的融合蛋白基因hns?gfp來調節大腸桿菌的細胞大小。結果表明，大腸桿菌在缺失碳儲存調節因子基因和過表達組氨酸類似物與綠色熒光蛋白融合蛋白的基礎上，通過控制誘導劑濃度可以實現大腸桿菌細胞大小的調控，與出發菌株相比，在不同的無水四環素(aTc)誘導下，大腸桿菌細胞大小可增加1379％。這為調控大腸桿菌細胞大小提供了一種新策略。

技術領域

本發明涉及一種調控大腸桿菌細胞大小的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

大腸桿菌(Escherichia coli)由于其遺傳背景清晰、基因操作手段成熟、具有較好的兼容性和快速生長優勢，在代謝工程和合成生物學方面已經成為目前應用最廣泛的宿主菌。同時，大腸桿菌也用于生產聚合物，例如聚羥基脂肪酸酯(PHA)、聚β羥基脂肪酸酯(PHB)等。

在發酵生產聚合物的過程中，胞內聚合物積累，會占據細胞內空間，嚴重影響細胞生長，從而降低聚合物的產量。大腸桿菌細胞形態微小，這不僅限制了聚合物的積累，而且增加了產品的分離成本。因此，有效地增加細胞大小是利用大腸桿菌生產聚合物過程中一個亟待解決的問題。目前，增加大腸桿菌細胞大小的方法主要是通過調控細胞壁的形成、調控肽聚糖的形成以及調控細胞分裂，但是這些方法在調控細胞大小的同時會導致細胞生長下降，同時該方法無法調整內含物在細胞中的分布。

發明內容

本發明的第一個目的是提供了一種調控大腸桿菌細胞大小的方法，在細胞培養過程中添加誘導劑，調節誘導劑的濃度以調節大腸桿菌細胞大小；所述大腸桿菌中不表達碳儲存調節因子，且過表達組氨酸類似物與綠色熒光蛋白的融合蛋白；所述不表達包括缺失或沉默。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導劑包括無水四環素。

在本發明的一種實施方式中，所述過表達是：采用四環素誘導型啟動子轉錄編碼組氨酸類似物與綠色熒光蛋白融合蛋白的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導劑的濃度為0～150ng/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述碳儲存調節因子的氨基酸序列與NCBI上accession number:947176的基因編碼的氨基酸序列一致。

在本發明的一種實施方式中，所述組氨酸類似物的氨基酸序列與NCBI上accession number:945829的基因編碼的氨基酸序列一致。

在本發明的一種實施方式中，所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列與NCBI上accession number:MK816963的基因編碼的氨基酸序列一致。

在本發明的一種實施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述大腸桿菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)JM109。所述Escherichia coli JM109是在TaKaRa上購買的大腸桿菌。

在本發明的一種實施方式中，所述不表達碳儲存調節因子具體是：

(1)根據Escherichia coli K-12中的csrA基因(NCBI accession number:947176)3`和5`端45bp序列設計攜帶有csrA同源臂的引物，采用PCR技術，以pKD4質粒為模板，擴增出含有csrA同源臂帶有卡那霉素抗性基因的敲除框；

(2)將上述敲除框導入含有pKD46質粒的大腸桿菌中。

在本發明的一種實施方式中，所述組氨酸類似物與綠色熒光蛋白融合蛋白的過表達具體是：