[發(fā)明專利]一種以脂肪酸為原料利用大腸桿菌工程菌制備α，β不飽和脂肪酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911038194.3
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110684794B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇靜;王芬;王瑞明;李巖;王麗;汪俊卿;袁海波;楊曉慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/53;C12N15/52;C12N15/60;C12N15/55;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南竹森知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一種利用大腸桿菌工程菌制備α，β不飽和脂肪酸的方法，其特征在于，步驟如下：

發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，超聲破碎菌體細(xì)胞，向破碎菌液中加入癸酸，35～40℃條件下利用無(wú)細(xì)胞體系生產(chǎn)反式-2-癸烯酸；

所述大腸桿菌工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒petDuet-FadE、重組質(zhì)粒pet28a-sumo-YdiI；

所述酯酰輔酶脫氫酶FadE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；酯酰CoA硫酯酶基因YdiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

（2）利用步驟（1）制得的重組質(zhì)粒petDuet-FadE,構(gòu)建petDuet-FadE-FadD質(zhì)粒；

脂酰CoA合成酶基因FadD的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

（3）利用RED重組法敲除FadR和FadB基因，構(gòu)建基因缺失菌株?FadRB；

（4）取步驟（1）、（2）制得的重組質(zhì)粒pet28a-sumo-YdiI和petDuet-FadE-FadD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到基因缺失菌株?FadRB，制得重組菌YED-?FadRB。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒petDuet-FadE，包括如下步驟：

以大腸桿菌BL21基因組為模板，擴(kuò)增酯酰輔酶脫氫酶FadE基因,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后將petDuet質(zhì)粒用HindIII進(jìn)行酶切、純化，再與酯酰輔酶脫氫酶FadE的基因進(jìn)行無(wú)縫克隆，制得重組質(zhì)粒petDuet-FadE；

PCR擴(kuò)增體系如下，總體系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH₂O19μL；

PCR擴(kuò)增條件如下：

95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循環(huán)30次；72℃延伸5min。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet28a-sumo-YdiI，包括如下步驟：

以大腸桿菌DH5a基因組為模板，擴(kuò)增酯酰CoA硫酯酶基因Y diI, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后將pet28a-sumo質(zhì)粒和酯酰CoA硫酯酶基因Y diI分別用BamH I和Xho I分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)連接酶連接，制得重組質(zhì)粒pet28a-sumo-YdiI；

PCR擴(kuò)增體系如下，總體系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH₂O19μL；

PCR擴(kuò)增條件如下：

95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循環(huán)30次；72℃延伸5min。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述連接酶連接條件為22℃連接10min。