[發(fā)明專(zhuān)利]一種酶融合蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911038022.6
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110734901B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉森林;陳偉釗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/42
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/42;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C11D3/386;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發(fā)明公開(kāi)一種酶融合蛋白及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明利用Overlap PCR技術(shù)獲得了由內(nèi)切葡聚糖酶Egh31及堿性內(nèi)切葡聚糖酶III?3酶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)構(gòu)成的融合酶Egh31?CBD，與原酶Egh31相比，融合酶的比活力(154.8U/mg)較原酶(135.7U/mg)提高約14％；融合酶的溫度穩(wěn)定性在55℃條件下得到較大的提高，原酶的相對(duì)酶活力僅為60％左右，融合酶為90％；在1％SDS條件下，原酶的相對(duì)酶活力僅為20％左右，融合酶為60％左右。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可表明：添加CBD結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Egh31內(nèi)切葡聚糖酶在紡織業(yè)的酶洗整理和洗滌劑工業(yè)具有更好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種酶融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

碳水化合物結(jié)合模塊CBM(carbohydrate-binding module)是在碳水化合物活性酶(例如糖苷水解酶)中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域中的大多數(shù)具有碳水化合物結(jié)合活性。CBM最早來(lái)自纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，基于保守氨基酸的相似性，CBM被歸為為許多家族，至2018年1月，CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在83個(gè)CBMs家族(http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。

內(nèi)切葡聚糖酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD，也稱CBM)一般呈“楔形”，一面親水，另一面疏水，使內(nèi)切酶能夠與結(jié)晶纖維素和無(wú)定形纖維素相結(jié)合。大部分纖維素酶的CBD位于蛋白分子結(jié)構(gòu)的氨基端或羧基端，極少數(shù)位于中間(Tomme et al.,1995)。

大部分纖維素酶含有CBD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并對(duì)酶的催化過(guò)程有影響。去除CBD的纖維素酶，對(duì)可溶性底物的降解效果影響較小，但作用于不溶底物時(shí)酶活力則大大降低(汪天虹等，2000)。

里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGI的CBD的吸附功能明顯比外切葡聚糖酶CBHI高，主要是因?yàn)樵陉P(guān)鍵結(jié)合區(qū)域色氨酸取代了酪氨酸(Linder et al.,1995)。Bolam等(1998)將來(lái)源于熒光假單胞菌纖維素酶及木聚糖酶的CBD與Clostridium thermocellum內(nèi)切葡聚糖酶EGE融合，使其降解結(jié)晶纖維素的能力大大提高，但對(duì)非結(jié)晶纖維素的降解能力則變化不大。Bae等(2003)將木聚糖酶XylA的CBM加入到內(nèi)切葡聚糖酶Cel5的C端，融合酶降解濾紙的比活力比原內(nèi)切葡聚糖酶Cel5提高了5倍。Gundllapalli等(2007)等將里氏木霉CBHII的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD2)加入到β-葡糖苷酶(BGL1)的N端，并在釀酒酵母中成功表達(dá)，融合酶對(duì)細(xì)菌微晶纖維素、羧甲基纖維素(CMC)的水解活性增加了2～4倍，表明加入CBD可增強(qiáng)對(duì)底物的親和力，增加酶分子的柔性。

但也有少數(shù)來(lái)源于微生物和高等植物的纖維素酶不具備結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EG3缺少CBD結(jié)構(gòu)域(Tomme et al.,1995)。雖然CBD對(duì)纖維素酶的催化活力是非必需的，但由于結(jié)合結(jié)構(gòu)域能使酶更多的與底物表面接觸，從而提高酶在底物表面的有效濃度，增加酶與底物接觸的效率，這可能對(duì)酶的催化效率的提升有正面的影響(Chhabraet al.,2002)。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種酶融合蛋白。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述酶融合蛋白的應(yīng)用。

為進(jìn)一步改進(jìn)酶的催化特性，本發(fā)明在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了酶分子改造：根據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶Egh31缺少結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為其C末端添加了來(lái)自Bacillus sp.Ⅲ-3菌株所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種酶融合蛋白，是內(nèi)切葡聚糖酶與Bacillus sp.Ⅲ-3菌株所產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD形成的融合蛋白。所述酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。