[發(fā)明專利]一種用于預測免疫檢測點調(diào)節(jié)類藥物療效的RT-PCR試劑盒及其預測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911037580.0
• 申請日: 2019-10-29
• 公開（公告）號: CN110564858A
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發(fā)明（設計）人: 張志新;卓越;文學平;鐘雪梅
• 申請（專利權）人: 成都益安博生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869
• 代理公司: 51229 成都正華專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李亞男

1.一種用于預測免疫檢測點調(diào)節(jié)類藥物療效的RT-PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于進行RT-PCR擴增的引物及其輔助成分；所述引物包括首輪RT-PCR擴增引物，以及對首輪擴增產(chǎn)物TCR區(qū)域進行第二輪PCR擴增的特異性引物；

所述首輪RT-PCR擴增引物如SEQ ID NO.1～40所示；所述第二輪PCR擴增特異性引物如SEQ ID NO.41～50所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的用于預測免疫檢測點調(diào)節(jié)類藥物療效的RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述輔助成分包括RT-PCR緩沖液、MgCl₂、dNTP、ddH₂O、酶。

3.采用權利要求1或2所述的試劑盒對免疫檢測點調(diào)節(jié)類藥物療效進行預測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品RNA；

(2)以待測樣品RNA模板進行反轉錄，然后對反轉錄制得的cDNA進行首輪RT-PCR擴增，收集純化擴增產(chǎn)物；

(3)再次對步驟(2)所得擴增產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增，以擴增TCR可變區(qū)，獲得可變區(qū)序列；

(4)基于步驟(3)所得可變區(qū)序列計算其D₅₀值。

4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述D₅₀值的計算方法如下：測序得到TCR可變區(qū)序列信息，比對確定可變區(qū)序列的總數(shù)記為N，與可變區(qū)基因的不同序列的類型數(shù)為C，每一種序列的拷貝數(shù)為N1、N2……NC，并按拷貝數(shù)從多到少以N1、N2……NC進行排序，拷貝數(shù)最多且占據(jù)功能性可變區(qū)序列總數(shù)50％的克隆類型數(shù)記為H，H與C的比值即為D₅₀。

5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述首輪RT-PCR擴增的反應體系中的TRTmix引物由SEQ ID NO:1～4所示引物等摩爾比濃度混合，然后再稀釋至20μM，或將SEQ ID NO:1～4所示引物中的各引物分別調(diào)整其濃度為20μM，然后再等體積混合；

所述Vβmix引物由SEQ ID NO:5～40所示引物等摩爾比濃度混合，然后再稀釋至20μM，或將SEQ ID NO:5～40所示引物中的各引物分別調(diào)整其濃度為20μM，然后再等體積混合。

6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述TCR可變區(qū)序列唯一性由CDR3序列確定。