[發(fā)明專利]創(chuàng)制植物單倍體誘導(dǎo)系的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911035463.0
• 申請(qǐng)日: 2019-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN112725374A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘燕林;丁琦;譚超;陳雅;徐念;李弘婧;王文舒;馬崇烈
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)種子集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N15/29;C12N15/113;A01H1/02;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11204
• 代理人: 王達(dá)佐;洪欣

本申請(qǐng)涉及創(chuàng)制植物單倍體誘導(dǎo)系的方法，其包括修飾植物中的CENH3基因，使其功能部分缺失。具體地，本申請(qǐng)涉及利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻OsCENH3基因，從而產(chǎn)生水稻單倍體誘導(dǎo)系，其具有誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)生的能力，這對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。本申請(qǐng)還涵蓋了利用單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的方法以及單倍體誘導(dǎo)系用于育種、進(jìn)行基因編輯、產(chǎn)生單倍體和產(chǎn)生新的單倍體誘導(dǎo)系的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本申請(qǐng)涉及創(chuàng)制植物單倍體誘 導(dǎo)系的方法及其應(yīng)用，特別涉及通過基因編輯CENH3基因而創(chuàng)制植物 單倍體誘導(dǎo)系，從而應(yīng)用于植物育種。

背景技術(shù)

雙單倍體育種技術(shù)，是利用自發(fā)或人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體植株加倍 后獲得純合的二倍體，再?gòu)闹羞x育目標(biāo)株系的育種技術(shù)。該技術(shù)較傳統(tǒng) 的選育技術(shù)而言，具有縮短育種周期、提高育種效率的優(yōu)勢(shì)。從玉米的 自然突變體中獲得的-單倍體誘導(dǎo)系Stock6，具有作為父本誘導(dǎo)母本單倍 體產(chǎn)生的能力，由Stock6派生出的一系列誘導(dǎo)系已經(jīng)成功運(yùn)用于商業(yè)化育 種。而水稻的單倍體育種工作目前還主要依靠花粉離體培養(yǎng)或遠(yuǎn)源雜交 等方式，受到誘導(dǎo)效率、基因型等因素制約，在育種上的應(yīng)用很受限， 當(dāng)然，也有通過基因編緝技術(shù)編緝OsMATL基因，獲得作為父本的單倍體 誘導(dǎo)系(劉君濤等，2018)的報(bào)道，但也存在較多的不足之處。

CENH3廣泛地存在于真核生物中，CENH3基因編碼著絲粒特異性組 蛋白3，是著絲粒的重要組成部分，在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)發(fā)揮重 要作用。植物中,科學(xué)家最早從擬南芥中克隆了CENH3基因,之后相繼從 水稻、甘蔗、煙草、大麥、玉米、胡蘿卜等植物中克隆了CENH3基因。 對(duì)不同物種的CENH3氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),CENH3的氨基端尾變異 性很高,而羧基端組蛋白折疊區(qū)(histone fold domain,HFD)相對(duì)保守 (Britt和Kuppu,2016)。HFD區(qū)的Loop 1和α2螺旋負(fù)責(zé)將CENH3靶標(biāo)到著 絲粒上,因此被命名為CENP-A靶標(biāo)區(qū)域(CENP-A target domain, CATD)。CENH3的翻譯后修飾通常發(fā)生在其氨基端尾巴上(Bailey et al., 2013)。N端尾巴結(jié)構(gòu)域和HFD結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑ENH3正常功能的發(fā)揮都有重要作用。

2010年,在進(jìn)行擬南芥cenh3突變體的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中,研究者將GFP與 其CENH3融合,融合蛋白在cenh3突變體中表達(dá)后能夠有效的互補(bǔ)其不育 的表型。將GFP、組蛋白H3.3的N端尾巴與CENH3 HFD區(qū)融合,得到 GFP-tailswap蛋白,同樣可以挽救cenh3突變體的胚性致死表型,該 GFP-tailswap株系高度的雄性不育,其自交后代都是正常的二倍體。作為 父本與野生型植株雜交后,后代有34％的個(gè)體為單倍體(Ravi和Chan, 2010)。Maheshwari等人將GFP-CENH3、來自葡萄和玉米的CENH3引入 擬南芥cenh3突變體中,這些不同版本的CENH3均能夠互補(bǔ)cenh3突變體 表型。將2個(gè)不同來源的CENH3的N末端尾巴或HFD區(qū)域調(diào)換后獲得的是 無功能或低效能的等位基因(Maheshwari等人，2015)。