[發明專利]一種控制豬PFKM表達的載體及其應用

在審

• 申請號: 201911029572.1
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN110724710A
• 公開（公告）日: 2020-01-24
• 發明（設計）人: 鞠輝明;許金蔓;楊躍飛
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/54
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 王灝增

本發明涉及一種重組載體，所述載體包括sgRNA的編碼基因和Cas9蛋白編碼基因，所述sgRNA的靶位點為序列1所示的DNA。本發明提供一種用于控制豬PFKM表達的載體，通過所述載體能夠控制豬細胞中的PFKM表達量，進而控制豬的肌肉的纖維組成，調節瘦肉率的變化。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及豬CRISPR/Cas9基因敲除質粒載體的構建。

背景技術

肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是在骨骼肌中廣泛表達的一類調節酶，它也是糖酵解的一個關鍵調節酶，是糖酵解中起決定作用的限速酶，其分子是一個四聚體形式。其功能和表達量的變化會通過調節靶基因的表達，改變肌肉的纖維組成(紅、白肌的比例)及造成瘦肉率變化。該基因的表達抑制有助于研究該基因的功能。gRNA長度約為80個核苷酸，包含兩個區域：gRNA5’端前20個核苷酸對應于靶標DNA，能結合在靶標DNA上，其中含有一PAM結構，能與由任意核苷酸序列(N)+5’末端兩個胞嘧啶核苷酸(-NCC)的DNA結合，即-NGG。剩余的約60個核苷酸形成一個發卡，此結構能幫助gRNA與Cas9結合，并由此指導與DNA的結合。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種控制豬PFKM表達的載體及相應的PFKM基因敲除細胞株。

本發明提供一種重組載體，所述載體包括sgRNA的編碼基因和Cas9蛋白編碼基因，所述sgRNA的靶位點為序列1所示的DNA。

其中，所述sgRNA為序列2所示的RNA。

其中，所述sgRNA的編碼基因的編碼序列為序列3。

其中，所述重組載體是在P1質粒的Bbsl識別位點處插入所述sgRNA的編碼基因，并保持所述PI質粒的其他核苷酸不變的重組載體，包括pYSY、CMV、U6、EF1a和Puromycin；

所述重組載體是在P1質粒的Bbsl識別位點處插入所述sgRNA的編碼基因，并保持所述PI質粒的其他核苷酸不變的重組載體。

其中，所述重組載體的核苷酸序列為序列4。

其中，所述重組載體為用于敲低豬PFKM基因表達的載體。

本發明涉及一種敲低豬細胞中PFKM基因表達的方法，包括將所述的控制豬PFKM基因表達的載體，導入豬細胞中，得到PFKM基因表達量降低的重組豬細胞。

本發明還要求保護下述任一應用：

X1、所述載體在控制PFKM基因表達中的應用；

X2、所述載體在制備控制PFKM基因表達的動物模型中的應用；

X3、所述載體在動物育種中的應用；

X4、所述的方法在制備控制PFKM基因表達的動物模型中的應用；

X5、所述的方法在動物育種中的應用。

本發明提供一種用于控制豬PFKM表達的載體，通過所述載體能夠控制豬細胞中的PFKM表達量，進而控制豬的肌肉的纖維組成，調節瘦肉率的變化。

附圖說明

圖1為重組載體酶切鑒定圖

圖2為雙酶切質粒電泳圖

圖3為96孔板中單個細胞孔圖；

圖4為96孔板中單細胞克隆圖；

圖5為細胞敲除株2株的測序峰圖；

圖6為細胞敲除株4株的測序峰圖；

圖7為各組敲除細胞株總RNA電泳圖；