[發明專利]基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201911028300.X
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN110760568A
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 李喆;彭勁;于涵洋
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6883
• 代理公司: 32242 江蘇銀創律師事務所
• 代理人: 何紅梅

本發明公開了基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法及其應用。首先非天然核酸單鏈通過堿基互補配對形成打開的納米鑷子結構，其中一條單鏈的5’與3’端分別標記熒光基團。然后利用非天然核酸穩定性高的特點，在細胞內使用納米鑷子檢測mRNA分子；當存在目標mRNA分子時，納米鑷子的單鏈部分將與之進行互補配對，從而關閉納米鑷子，使熒光基團之間發生能量共振轉移，通過光學信號的變化達到檢測效果。最后加入燃料單鏈使納米鑷子恢復打開狀態，使之可以進行下一輪檢測。本發明高靈敏度的細胞無損檢測。基于熒光共振能量轉移的納米鑷子，具有極高的檢測靈敏度，檢測速度快，且具有良好的生物相容性，可直接進入細胞進行無損檢測。

技術領域

本發明涉及檢測分析及生物學技術領域，具體涉及基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法及其應用。

背景技術

mRNA是生物體內的重要生物大分子之一，它在細胞內的表達水平、穩定性、時間空間分布與其功能緊密相關。對mRNA表達變化的實時檢測，將極大的促進疾病診斷與監測水平的提高，因而引發越來越廣泛的研究興趣。

目前，科研人員主要通過提取、純化細胞裂解液中的mRNA，再通過聚合酶鏈式反應等方法在細胞水平對mRNA的表達進行定量分析。這些方法由于需要對細胞進行破壞，因而無法全面獲取活細胞生命活動的相關信息。近年來，分子信標被廣泛應用于活細胞內mRNA的檢測。它易于構建和表征，不需要破壞細胞或重組基因來檢測細胞中的mRNA表達。然而分子信標很容易被體內的酶或其他成分降解，導致熒光染料與猝滅分子之間的距離增大，從而產生錯誤信號，且無法動態可逆的實時檢測mRNA。

在DNA納米技術領域，人工設計并合成的DNA單鏈被用來組裝形成各種二維及三維結構。DNA納米結構具有復雜精細的可編程圖案，以及很好的位點可尋址性，在藥物傳遞、分子計算、納米光學器件等領域具有廣泛的應用價值。在利用DNA納米結構進行生物分子檢測方面，研究者們主要：1、在體外利用AFM探針對DNA納米結構與生物分子的結合實現直接可視；2、在細胞內利用熒光DNA探針進行熒光成像。相比分子信標，DNA納米結構具備更強的抗酶切保護性能；然而由于其結構由天然核酸構建形成，所以仍然易被體內成分降解。

與天然核酸相比，非天然核酸具有類似的堿基互補配對能力，因而具備對目標核酸鏈的特異性識別功能；同時，非天然核酸具有更好的抗酶切、耐酸、耐熱等特性，因而在細胞內具有更高的穩定性。將非天然核酸與納米結構相結合，將可以解決天然核酸在細胞內易降解等問題，從而實現在活細胞內長期動態監測mRNA的目的。

目前，缺乏一種具有較高的靈敏度的基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法及其應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有較高的靈敏度的基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法及其應用。

本發明的技術方案如下：本發明的一種基于非天然核酸納米鑷子的特異性檢測技術在活細胞mRNA檢測中的檢測方法，包括如下步驟：

(1)設計并合成非天然核酸納米鑷子；

(2)使用納米鑷子對活細胞內目標mRNA進行檢測；

(3)進行熒光光譜分析。

進一步地，在步驟(1)中，所述的不同非天然核酸納米鑷子的構建，設計三條非天然核酸單鏈：中心鏈的兩端采用兩種可發生能量共振轉移的熒光基團進行標記，另外兩條單鏈分別延伸出幾個堿基序列，用于與目標的mRNA進行堿基互補配對；可以針對不同的檢測環境要求，改變非天然核酸的化學種類來實現。