[發明專利]一種用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法

在審

• 申請號: 201911002140.1
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN110734969A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 徐瑤;宋如晦;石偉林;代洋;許娜;廖興華;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/683
• 代理公司: 42242 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 王振宇

1.一種用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環境、Mg++、dNTPs存在的情況下，利用聚合酶鏈式反應引物對P進行PCR擴增，然后利用限制性內切酶對其進行酶切，再通過電泳檢測即可準確鑒定待測樣本的單核苷酸多態性。

2.如權利要求1所述用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的聚合酶鏈式反應引物對P為：

上游引物P-F：5’-CCTGGAGTACCAGGAAGGACAGC-3’23nt

下游引物P-R：5’-TTACACGTATGAGCCACC-3’18nt

引物P-F中帶有下劃線的堿基為錯配堿基，目的是引入Hha I的酶切位點；

PCR擴增后，將產物一分為二，一部分PCR產物用限制性內切酶HhaI進行消化，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定CREB1基因第-1354位的堿基多態性；另一部分PCR產物用限制性內切酶Xsp I進行消化，再對酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定CREB1基因第-1343位的堿基多態性。

3.一種權利要求1所述用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述的PCR擴增條件是：20μL反應體系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10μL(內含Mg++、dNTPs等)，0.45μL基因組DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和滅菌超純水8.3μL；

所述的PCR反應程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，35個循環；72℃延伸10min。

4.根據權利要求1所述的用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的濃度都為3.0％。

5.根據權利要求1所述的用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于，檢測到的人CREB1基因啟動子區多態性為：基因組第-1354位T>G突變；基因組第-1343位T>A突變。

6.根據權利要求1所述的用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通過電泳判定CREB1基因第-1354位的堿基多態性為：TT基因型表現為161bp條帶；TG基因型表現為161、139和22bp條帶；GG基因型表現為139和22bp條帶。

7.根據權利要求1所述的用于檢測基因CREB1單核苷酸多態性的PCR-RFLP方法，其特征在于，通過電泳判定CREB1基因第-1343位的堿基多態性為：AA基因型表現為161bp條帶；AT基因型表現為161、125和36bp條帶；TT基因型表現為125和36bp條帶。