[發明專利]一種貝類血細胞胞外陷阱的誘導方法及其應用

有效

• 申請號: 201910998502.0
• 申請日: 2019-10-21
• 公開（公告）號: CN110484503B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 楊頂瓏;韓怡靜;趙建民
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 馬國冉

本發明涉及一種貝類血細胞胞外陷阱的誘導方法。采用酵母多糖對貝類血細胞進行誘導，獲得發生胞外陷阱的貝類血細胞。有益效果：將蛤仔血細胞用酵母多糖誘導，使得血細胞胞外陷阱的發生。本發明的方法能夠有效誘導蛤仔血細胞發生胞外陷阱，并抑制細菌生長。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，尤其涉及一種貝類血細胞胞外陷阱的誘導方法及其應用。

背景技術

胞外陷阱（extracellular traps, ETs）是一種不同于凋亡和壞死的新型細胞死亡方式，是以細胞內核酸為骨架，負載抗菌肽和水解酶組成網狀結構，能夠包裹并殺傷外來入侵的病原微生物。2004年，Brinkmann等在嗜中性粒細胞中發現了胞外陷阱現象，其主要在細胞吞噬和脫顆粒反應之后發揮作用。隨后，國內外學者在高等生物的肥大細胞、酸性粒細胞、巨噬細胞等細胞中，相繼發現了胞外陷阱的存在，認為其僅存在于固有免疫細胞中。在固有免疫反應中，胞外陷阱可阻止病原微生物由入侵位置向周邊組織擴散，集中多種抗菌肽而使局部抗菌肽濃度升高，加大對病原微生物的殺滅作用，亦可形成不依賴于殺傷作用的防御系統，捕獲入侵微生物并阻止其遷移。

不同類型的細胞具有不同的胞外陷阱誘導機制，例如，細菌和真菌均可以誘導巨噬細胞和粒細胞釋放胞外陷阱，且體積較大的微生物誘導胞外陷阱釋放的能力更強。此外，脂多糖（LPS）、佛波酯（PMA）可誘導中性粒細胞發生胞外陷阱，但它們并不能有效地誘導巨噬細胞發生胞外陷阱。研究發現，胞外陷阱形成過程中通常伴隨著多種免疫效應因子的發生，這些免疫蛋白可破壞微生物的細胞壁或細胞膜結構，阻止微生物生長。此類免疫因子主要是一些攜帶高電荷的肽類和蛋白質類，包括防御素、內源性抗菌肽類、髓過氧化物酶、細菌通透性增強蛋白和陽離子絲氨酸蛋白酶等，它們可協同抗菌，大大提高殺菌效果。作為一種新的殺菌策略，胞外陷阱可以在低耗能的情況下對細菌形成包裹；促進免疫效應因子與微生物充分接觸，提高抗菌效率；減小對病灶及周邊組織的損傷；調節炎癥反應等。雖然胞外陷阱抗菌效果顯著，但是如果過度形成或未及時清除，這種富含水解酶和DNA的膠黏網狀結構可附著于組織內，引起細胞凋亡，直接導致組織損傷，同時胞外陷阱也可通過釋放內源性危險信號，誘導自身免疫的發生。

海洋無脊椎動物通常生活在富含微生物的水環境中，經常面臨著多種病原微生物的侵襲。胞外陷阱是固有免疫細胞特有的一種免疫方式，在抵御病原微生物入侵方面作用顯著。目前，有關海洋無脊椎動物胞外陷阱的研究仍然以激活途徑、殺菌活性等研究內容為主。迄今為止，國內學者對海洋無脊椎動物胞外陷阱的研究較少，而國外學者也僅在長牡蠣、日本對蝦、南美白對蝦等少數幾種海洋無脊椎動物中報道了胞外陷阱的存在。在長牡蠣中，血細胞胞外陷阱的形成過程中往往伴隨著組蛋白H1和H5的釋放，以應對感染和組織損傷。釋放的胞外陷阱可以包被弧菌，阻止其遷移。而在日本對蝦中，胞外陷阱可被PMA、LPS、肽聚糖（PGN）和大腸桿菌誘導，釋放時往往伴隨著溶菌酶的發生。在致病菌較多的情況下，胞外陷阱的抑菌作用優于吞噬作用，經過DNase I處理后，胞外陷阱的抗菌活性受到明顯抑制。目前，對于海洋軟體動物胞外陷阱的研究較少，對于胞外陷阱形成過程和作用機制缺乏系統而深入的研究，對胞外陷阱的應用潛能尚無開發。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明提供一種貝類血細胞胞外陷阱的誘導方法。本發明的方法能夠有效誘導蛤仔血細胞發生胞外陷阱。

本發明一種貝類血細胞胞外陷阱的誘導方法，采用酵母多糖對貝類血細胞進行誘導，獲得發生胞外陷阱的貝類血細胞。

進一步的，采用100-500ng/ml的酵母多糖對貝類血細胞進行處理0.5-1小時。

進一步的，采用500ng/ml的酵母多糖對貝類血細胞進行處理1小時。

進一步的，所述貝類是菲律賓蛤仔。

本發明還提供一種貝類血細胞胞外陷阱，如上述的誘導方法誘導得到。