[發明專利]一種產R-(+)-紫蘇醇的基因工程菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201910993852.8
• 申請日: 2019-10-18
• 公開（公告）號: CN110669712A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 孫超;張汝兵;咸漠;董先娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/61;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司
• 代理人: 鄧宇

1.一種產R-(+)-紫蘇醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表達HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基轉移酶mvaE、牦牛兒基焦磷酸合成酶基因GPPS、D-檸檬烯合成酶基因ClLS、對異丙基甲苯單氧合酶羥化酶基因cymAa、對異丙基甲苯單氧酶還原酶基因cymAb、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羥戊酸脫羧酶ERG19基因和異戊焦磷酸異構酶IDI基因，宿主菌為大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBank ID為AAG02439，來源于糞腸球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基轉移酶基因mvaE，GenBank NO.AAG02438，來源于糞腸球菌E.facecalis；焦磷酸合成酶GPPS基因，GenbankNo.AF513112.1，來源于巨冷衫Abies grandis；D-檸檬烯合成酶ClLS基因，GenbankNo.AF514287.1，來源于檸檬Citrus limon；對異丙基甲苯單氧合酶羥化酶cymAa基因，Genbank No.AAB62299.1，來源惡臭假單胞菌Pseudomonas putida F1；對異丙基甲苯單氧酶還原酶cymAb基因，Genbank No.AAB62300.1來源惡臭假單胞菌Pseudomonas putida F1；MVA激酶ERG12基因，GeneBank ID：855248，來源Saccharomyces cerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBank ID：855260，來源Saccharomyces cerevisiae、甲羥戊酸脫羧酶ERG19基因，GeneBank ID：855779，來源Saccharomyces cerevisiae、異戊焦磷酸異構酶IDI基因GeneBank ID：855986，來源Saccharomyces cerevisiae。

3.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)。

4.權利要求1-3任意一項所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)構建重組質粒：分別構建包含mvaS、mvaE、GPPS、ClLS、cymAa和cymAb的重組質粒I和包含ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因的重組質粒II；

2)將步驟1)構建的重組質粒I和重組質粒II轉化入宿主菌，得到產R-(+)-紫蘇醇的工程菌。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述重組質粒I構建時用的中間載體為pET28a(+)；構建重組質粒II構建時所用的中間載體為pTrcHis2B。

6.權利要求1-3任意一項所述的基因工程菌在發酵生產R-(+)-紫蘇醇中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述發酵生產R-(+)-紫蘇醇的方法包括：將權利要求1-3任意一項所述的基因工程菌接種至發酵培養基中，發酵培養至OD₆₀₀為18-20，然后加入誘導劑IPTG和維生素B2，誘導培養后加入鄰苯二甲酸二異壬酯，補料發酵，然后將得到的培養液進行離心取上清液，上清液采用乙酸乙酯萃取得到R-(+)-紫蘇醇。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述發酵培養是指按照接種量為培養基體積的1％-2％將基因工程菌接種于發酵培養基，培養溫度為30-37℃，攪拌速度為400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧20％以上，培養至OD₆₀₀為18-20。

9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述誘導劑IPTG在發酵培養液中的終濃度為0.2mmol/L，所述維生素B2在發酵培養液中的終濃度為50μmol/L。

10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，以發酵培養液體積計，所述鄰苯二甲酸二異壬酯加入量為5％-10％(質量體積比)；所述補料發酵條件為30℃、180rpm，發酵24-48h。