[發明專利]一種高效的血漿、紅細胞、淋巴細胞NAD+

在審

• 申請號: 201910986885.X
• 申請日: 2019-10-17
• 公開（公告）號: CN112684160A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 白玉杰;董紅宇;林思妮;孫海星;張曉娟;王建輝;張艷;吳東穎
• 申請（專利權）人: 濰坊峽山荊衛生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種NAD⁺檢測方法，能快速靈敏地檢測血漿、紅細胞、淋巴細胞中的NAD⁺水平，屬于分子生物學和醫學檢測領域。采用酶循環法原理，NAD⁺在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下被還原為NADH，NADH在電子耦合試劑PMS的作用下將MTT還原生成藍色的甲臜，通過酶動力學方法檢測甲臜的生成速率，結合NAD⁺標準曲線即可獲得樣品中NAD⁺的量。主要包括以下步驟：樣本制備、試劑制備、r?SBFA制備、β?NAD標準品制備、反應液制備、NAD⁺提取、干擾物質去除、NAD⁺檢測和數據校準。本發明適用于哺乳動物血漿、紅細胞、淋巴細胞中NAD⁺水平檢測，獨特的樣本處理方法解決了樣本干擾物質多NAD⁺難以檢測的問題，并且具有檢測限低、花費時間短、成本低的優點，適合高通量檢測，易于推廣使用，實用性較強。

技術領域

本發明涉及分子生物技術和醫學檢測領域，尤其涉及一種高效的血液NAD⁺檢測方法，能夠全面評價哺乳動物血漿、紅細胞、淋巴細胞的NAD⁺水平。

背景技術

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是吡啶核苷酸家族的重要成員，它既是介導多種氧化還原反應的經典輔酶，也是Sirtuins、PARPs、CD38等酶的共底物，在能量代謝、細胞信號轉導、基因表達及基因組穩定等方面發揮著關鍵作用。研究表明，機體內NAD⁺水平會隨著年齡的增長而下降，這種下降在衰老和衰老相關疾病的發生發展中起著至關重要的作用。目前NAD⁺作為延緩衰老和延長壽命的重要靶點，在生物藥理學和未來疾病研究中的作用日益突出，因此開發一種可靠的NAD⁺檢測方法至關重要。由于哺乳動物血液中含有豐富的NAD⁺轉化酶，以及氧化型NAD⁺與還原型NADH自動轉化，所以NAD⁺檢測結果易受樣品采集、提取方法的影響，除此之外NAD⁺檢測極易受血漿蛋白、血紅蛋白、細胞裂解物等干擾物質的影響，因此準確測定血液NAD⁺在技術上具有挑戰性。

目前常采用高效液相色譜（HPLC）、高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）、液相二級質譜（HPLC-MS/MS）以及酶循環法檢測NAD⁺。HPLC法需要在所有樣品中加入內標，易受信號屏蔽和電離作用的抑制，導致NAD⁺難以準確量化；HPLC-MS/HPLC-MS/MS法結合色譜和質譜的優勢，顯著提高了檢測的靈敏度和特異性；但是高效液相色譜儀和質譜儀價格昂貴，檢測限高，耗時且通量低，這限制了它們的應用。酶循環法采用乙醇脫氫酶（Alcoholdehydrogenase，ADH）的催化特性及酶偶聯反應的原理，使反應體系中的NAD⁺轉化為NADH，通過氧化還原指示劑的介導作用，過度放大微量吡啶核苷酸的信號，從而提高檢出能力。酶循環法僅需要一臺酶標儀和酶標板，成本低、通量高，在NAD⁺檢測中具有重要的應用價值。

發明內容

本發明旨在解決快速準確測定哺乳動物血漿、紅細胞、淋巴細胞中的NAD⁺水平，獨特的樣本處理方法解決了樣本中干擾物質多NAD⁺難以檢測的問題，采用本發明檢測NAD⁺水平，檢測限低、花費時間短、成本低，適合高通量檢測。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

一種高效的血漿、紅細胞、淋巴細胞NAD⁺檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）樣本制備：采集哺乳動物新鮮外周血，肝素鋰抗凝，分離血漿，剩余部分采用淋巴細胞分離液，分離出紅細胞和淋巴細胞，清洗后細胞計數。血漿、紅細胞、淋巴細胞樣本制備完成后，立即檢測或液氮速凍后轉至-80℃保存。