[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)重油出芽短梗霉菌株及其構(gòu)建方法與用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910978113.1
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110713940B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 陳葉福;黃思瑤;鄭鵬;王遠花;郭建;郭學武;肖冬光
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12N15/90;C12N15/60;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 張倩

1.一種提高重油產(chǎn)量的出芽短梗霉重組菌株，其特征在于：所述重組菌株以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)P30菌株為出發(fā)菌株，通過用檸檬酸裂解酶基因ACL替換普魯蘭合成酶基因PUL；并通過強啟動子過表達基因ACL實現(xiàn)的；所述檸檬酸裂解酶基因ACL的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述普魯蘭合成酶基因PUL的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述P30菌株的保藏編號為CGMCC No.13988。

2.如權(quán)利要求1所述一種提高重油產(chǎn)量的出芽短梗霉重組菌株，其特征在于：所述強啟動子為核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的啟動子PGK。

3.權(quán)利要求1或2所述提高重油產(chǎn)量的出芽短梗霉重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：

以出芽短梗霉菌P30為出發(fā)菌株，以普魯蘭合成酶基因PUL為整合位點，將基因PUL的上游同源臂FA、抗性基因hgy片段、啟動子PGK、基因ACL、終止子GAP以及基因PUL的下游同源臂FB按順序依次連接并插入到整合位點上，同源重組后獲得重組菌株；所述啟動子PGK的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述終止子GAP的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.如權(quán)利要求3所述提高重油產(chǎn)量的出芽短梗霉重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)以所述出芽短梗霉P30菌株的基因組為模板，PCR擴增得到普魯蘭合成酶基因PUL的上游同源臂FA和下游同源臂FB，啟動子PGK和終止子GAP，以及基因ACL；

(2)從攜帶有抗性基因hgy的質(zhì)粒中通過PCR擴增得到潮霉素抗性基因hgy片段；

(3)利用電轉(zhuǎn)化的方法將上述PCR擴增產(chǎn)物：將所述上游同源臂FA、抗性基因hgy片段、啟動子PGK、基因ACL、終止子GAP以及基因PUL的下游同源臂FB，按順序依次連接并插入到整合位點上，同源重組后獲得PGK強啟動子過表達ACL基因的重組菌株。

5.權(quán)利要求1或2所述出芽短梗霉重組菌株在發(fā)酵生產(chǎn)重油中的用途。

6.如權(quán)利要求5所述出芽短梗霉重組菌株在發(fā)酵生產(chǎn)重油中的用途，其特征在于：所述出芽短梗霉重組菌株生產(chǎn)重油的發(fā)酵方法，具體如下：

挑取菌種接種于種子培養(yǎng)基中，28-30℃，200-240r/min振蕩培養(yǎng)20-24h，得到種子液；將所述種子液以6％-8％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵條件為28-30℃，200-240r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵5-7天結(jié)束；

所述種子培養(yǎng)基組成為：木糖20g/L，酵母浸粉1.0g/L，K₂HPO₄4.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.8g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 4.0g/L，余量為水，pH 5.5-6.5，121℃滅菌20min；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：木糖50g/L，酵母浸粉1.4-2.0g/L，KNO₃ 0.8g/L，NaCl 2.0g/L，K₂HPO₄ 5.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，余量為水，pH 4.5-5.5，121℃滅菌20min。