[發(fā)明專(zhuān)利]具有除草劑麥草畏降解功能的基因DICX4及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910977573.2
• 申請(qǐng)日: 2019-10-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111118037B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林敏;周正富;張維;郭倩楠;陳明;陸偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/31
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/31;C12N15/70;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發(fā)明從我國(guó)南方某制藥廠周?chē)寥罉悠返暮昊蚪M中獲得了一種具有降解除草劑麥草畏的基因dicX4。本發(fā)明構(gòu)建了含有該基因的重組載體，將其在原核宿主細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，所述基因在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，具有降解除草劑麥草畏的功能，可用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有降解除草劑麥草畏功能的基因。

背景技術(shù)

麥草畏(Dicamba)，又名百草敵、麥草威，是一種具有選擇性和內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗后生長(zhǎng)素類(lèi)除草劑。1961年，麥草畏由美國(guó)維爾斯科爾化學(xué)公司(Velsicol ChemicalCorporation)于創(chuàng)制，化學(xué)名為3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，CAS：1918-00-9，分子量為221.04。室溫條件下，在水中的溶解度為6.5g/L，宜在干燥、密閉、陰涼遮光下保存。其化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。

麥草畏一般作莖葉處理劑，苗后噴霧，玉米四葉期和拔節(jié)前施用。由于麥草畏的內(nèi)吸傳導(dǎo)性好，在較短時(shí)間內(nèi)可通過(guò)雜草的莖、葉或根被內(nèi)吸，可以將雜草連根殺死。在土壤中穩(wěn)定且較易移動(dòng)，有一定的殘效期，一般能保持40天以上。近年來(lái)，隨著麥草畏的過(guò)度使用，造成其在土壤中的殘留十分嚴(yán)重，因此，越來(lái)越多的科研工作者開(kāi)始研究麥草畏在土壤中的降解問(wèn)題。目前，對(duì)麥草畏的降解機(jī)制還不清晰，無(wú)法針對(duì)靶蛋白進(jìn)行研究。僅針對(duì)麥草畏降解酶基因的克隆和獲取開(kāi)展了部分研究。

微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的壓力選擇，進(jìn)化出一系列適應(yīng)該生境的生存機(jī)制與功能基因。這些菌株基因組中蘊(yùn)藏著豐富的基因資源，值得進(jìn)行深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一種新的除草劑麥草畏降解基因，其編碼的蛋白質(zhì)能夠用于麥草畏分子的降解。

本發(fā)明從我國(guó)南方某制藥廠周?chē)寥罉悠返奈⑸锖昊蚪M數(shù)據(jù)中獲得了一種具有降解除草劑麥草畏的基因dicX4。通過(guò)構(gòu)建了該基因的表達(dá)載體，將其在除草劑降解篩選菌株大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，所述基因在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，具有降解除草劑麥草畏的功能，可用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)。具體研究工作如下：

1、獲得了含有dicX4基因的重組工程菌株

1)通過(guò)PCR從南方某制藥廠周?chē)寥罉悠返奈⑸锖昊蚪M擴(kuò)增出dicX4基因，，其大小為1086bp，該基因編碼361個(gè)氨基酸，將其克隆于載體pJET上，構(gòu)建了含有完整dicX4基因的重組克隆質(zhì)粒pJET-dicX4；

2)將dicX4基因連接于pRAD1質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含組成型高表達(dá)groEL啟動(dòng)子，可高效持續(xù)表達(dá)下游靶標(biāo)蛋白。構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒pRAD-dicX4；

3)將導(dǎo)入dicX4基因的重組質(zhì)粒pRAD-dicX4轉(zhuǎn)入麥草畏降解基因篩選菌株大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM-dicX4(詳見(jiàn)實(shí)施例1)；

2、表達(dá)dicX4的重組大腸桿菌工程菌株的催化活性實(shí)驗(yàn)

已有研究表明，除草劑麥草畏降解的關(guān)鍵步驟在于麥草畏分子的去甲氧基化反應(yīng)。經(jīng)過(guò)微生物酶的催化將除草劑麥草畏去甲氧基生成無(wú)除草劑活性的3,6-二氯水楊酸(DCSA)。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)dicX4基因的重組工程菌JM-dicX4能夠在以麥草畏為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，具有降解除草劑麥草畏的能力。向培養(yǎng)基中添加除草劑麥草畏化合物后，經(jīng)過(guò)48小時(shí)孵育，表達(dá)dicX4的重組大腸桿菌工程菌株JM-dicX4能夠?qū)Ⅺ湶菸贩肿油耆到?，生成去甲基的無(wú)除草劑活性的DCSA。

實(shí)驗(yàn)表明，重組表達(dá)的DicX4蛋白質(zhì)具有降解除草劑麥草畏的催化功能，降解產(chǎn)物主要為無(wú)除草劑活性的3,6-二氯水楊酸(DCSA)。該基因在抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)方面具有應(yīng)用潛力。

序列表信息

SEQ ID NO.1：dicX4基因的核苷酸序列。