[發明專利]一種高產雪腐鐮刀烯醇的野生菌株及其突變體的構建方法

有效

• 申請號: 201910977090.2
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110616155B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 劉馨;董飛;蔣翊宸;王剛;王淑芳;赫丹;徐劍宏;史建榮
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12N1/15;C12N15/80;C12P17/18;C12R1/77
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 陳麗萍

本發明涉及一種高產雪腐鐮刀烯醇的野生菌株及其突變體的構建方法，其包括：(1)篩選獲得一株高產雪腐鐮刀烯醇的野生型亞洲鐮刀菌，產雪腐鐮刀烯醇量為來源菌株平均產量的18.34倍；(2)通過Double?joint PCR方法構建野生型亞洲鐮刀菌雪腐鐮刀烯醇生物合成負調控基因FaFlbA的敲除載體，并利用PEG介導的原生質體轉化方法獲得野生型亞洲鐮刀菌的原位替換突變體。本發明亞洲鐮刀菌RR108菌株的FaFlbA基因缺失突變體中雪腐鐮刀烯醇的產量顯著提高，在大米培養基中約為野生型菌株的9.42倍。所述的野生菌株和原位替換突變體可以用于雪腐鐮刀烯醇標準品制備，對于保障小麥的質量安全具有重要意義。

技術領域

本發明涉及種一種高產雪腐鐮刀烯醇的野生菌株及其突變體的構建方法，具體涉及通過自然篩選獲得的高產雪腐鐮刀烯醇的野生菌株并以其作為基礎菌株通過靶向基因敲除技術構建得到雪腐鐮刀烯醇高產突變菌株突變體。

背景技術

小麥是全球種植面積最大、總產量最高、也是最為重要的糧食作物，超過1/3的世界人口以小麥制品為主食。2018年我國小麥播種面積達到1664萬公頃，總產量約1.34億噸，小麥是中國半數以上人口的主糧，小麥及其制品的質量安全直接關系到我國過半人口的食品安全。禾谷鐮刀菌復合種(Fusarium graminearum species complex，FGSC)侵染小麥引起赤霉病，不僅會造成巨大的糧食減產，而且其侵染過程中會產生多種鐮刀菌毒素，目前已經獲知的鐮刀菌毒素包括單端孢霉烯A族的T-2毒素和HT-2毒素、單端孢霉烯B族的雪腐鐮刀烯醇(nivalenol，NIV)和脫氧雪腐鐮刀烯醇(deoxynivalenol，DON)以及玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等。這些有毒的次生代謝產物具有細胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性、生殖毒性和致癌、致畸及致突變作用，給食品安全和人畜健康造成嚴重威脅。

亞洲國家的優勢菌群為亞洲鐮刀菌(Fusarium asiaticum)，主要產3ADON(脫氧雪腐鐮 刀烯醇的乙酰化化學型)和雪腐鐮刀烯醇，我國是鐮刀菌毒素受害最為嚴重的國家之一，我國政府部門高度重視鐮刀菌毒素污染，國家標準制定了較歐美國家更為嚴苛的小麥及面粉中脫氧雪腐鐮刀烯醇限量標準(1000μg/kg)，但目前尚未制定雪腐鐮刀烯醇限量的相關法規。據研究表明雪腐鐮刀烯醇相比于脫氧雪腐鐮刀烯醇的毒性更強，急性中毒癥狀表現為鎮靜、眼瞼閉合、步態蹣跚、腹瀉和肺、消化道充血、厭食等；慢性中毒癥狀表現為動物的體重降低，各臟器質量減輕伴隨腫瘤發生。細胞毒性試驗結果也顯示雪腐鐮刀烯醇比DON的更易致突變，存在致癌風險，國際癌癥研究機構將其歸類為3類致癌物。鑒于上述，從長遠的觀點而言，應當對雪腐鐮刀烯醇發生的風險評估和污染防治應當給予高度重視。

長期監測雪腐鐮刀烯醇的發生風險需要建立精準的儀器檢測方法，獲得高純雪腐鐮刀烯醇標準品則成為進行有效監測的先決條件。目前雪腐鐮刀烯醇標準品主要依賴進口，且價格非常昂貴(1mg的雪腐鐮刀烯醇標品價格約折合人民幣1.8萬元)。此外，近年來為研發糧食污染后處理方案，真菌毒素的生物脫毒成為研究熱點。黃曲霉毒素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等的毒素降解微生物逐步用于污染糧食的脫毒處理，而對于雪腐鐮刀烯醇而言昂貴的標準品也完全限制了其降解微生物的篩選工作的進展。因此，如能在雪腐鐮刀烯醇標準品的制備上有所突破將為雪腐鐮刀烯醇的暴露評估與控制提供測量校準和質量控制，對于保障小麥產品的質量安全有著重要的意義。

中國發明專利201610041250.9公開了一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物及方法，所述誘導物為2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環單磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環單磷酸鈉鹽或8～12mg/ml的咖啡因。該發明采用cAMP、cAMP鈉鹽或咖啡因誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，使得其產毒量及毒素合成周期縮短，但由于其基因未發生變化，其產量提高有限。