[發明專利]數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針

在審

• 申請號: 201910976660.6
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110669845A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 王玲玲;楊傳燕;劉兆群;張玉坤;孔寧;葛欣淼;宋林生
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 21220 大連非凡專利事務所
• 代理人: 閃紅霞

本發明公開一種數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針，其特征在于所述引物及探針核苷酸序列如下：正向引物：5’?gctccgatgattgccagtct?3’；反向引物：5’?agtgctgcggaacc?3’；探針：5’?agtgctgcggaacc?3’；所述探針添加的熒光基團為6?羧基熒光素。引物及探針的準確性和特異性高，故可利用數字PCR技術檢測海灣扇貝MT1表達量的時序變化，以此作為評價養殖海灣扇貝健康狀況的指標，所建立的評價體系在養殖海灣扇貝病害預警預報中具有潛在應用價值。不需要設置對照組，也無需內參基因（Internal control），突破了傳統熒光實時定量PCR檢測方法的應用局限。

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物化學技術領域，尤其涉及一種數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針。

背景技術

MTs（金屬硫蛋白）是一類低分子量、富含半胱氨酸、可結合重金屬的蛋白質，廣泛存在于生物體內。MTs的一個主要生理功能是穩態調節細胞內金屬水平，即參與生物體內必需金屬元素的調節和非必需金屬元素的解毒作用。另外，MTs作為非酶抗氧化劑參與活性氧的清除，其清除羥自由基（HO?）和超氧陰離子自由基（O^2-）的能力約是還原型谷胱甘肽的50~100倍。與上述功能相對應，MTs的重要特征之一是在轉錄水平上被重金屬、高溫、低氧等非生物脅迫和細菌等生物脅迫顯著誘導表達，且誘導水平與環境中各種脅迫的程度直接相關。因此，水生生物MTs水平可作為指示水環境污染物暴露和毒性效應早期警報的重要生物標志物，對于水環境重金屬等污染物濃度的監測具有重要參考價值；同時，水生生物MTs水平可以指示高溫、低氧等引發的免疫應答反應，對于水生生物健康狀態評價及環境脅迫發生預警具有潛在應用價值。

熒光實時定量PCR（Quantitative real-time PCR，簡稱qPCR）是用于檢測基因mRNA表達水平的經典方法。但此方法只能用于檢測基因的相對表達水平，需要設置對照組并選取合適的管家基因作為內參，因此qPCR技術的應用具有很大局限性。相對地，數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術，能夠直接檢出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量，符合野外調查的需要。但是，迄今為止，沒有關于數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針的相關報道，以至于并沒有基于數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量并以此作為評價養殖海灣扇貝健康狀況的指標。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針。

本發明的技術解決方案是：一種數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針，其特征在于所述引物及探針核苷酸序列如下：

正向引物：5’- GCTCCGATGATTGCCAGTCT-3’；

反向引物：5’- AGTGCTGCGGAACC -3’；

探針：5’- AGTGCTGCGGAACC -3’；

所述探針添加的熒光基團為6-羧基熒光素。

本發明設計的數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的引物及探針的準確性和特異性高，故可利用數字PCR技術檢測數字PCR檢測海灣扇貝MT1表達量的時序變化，以此作為評價養殖海灣扇貝健康狀況的指標，所建立的評價體系在養殖海灣扇貝病害預警預報中具有潛在應用價值。不需要設置對照組，也無需內參基因（Internal control），突破了傳統熒光實時定量PCR檢測方法的應用局限。

附圖說明

圖1為本發明實施例中海灣扇貝鰓中AiMT1的qPCR擴增曲線（A）和反應程序（B）圖。

圖2為本發明實施例中海灣扇貝鰓中AiMT1的數字PCR引物和探針的特異性檢測圖。