[發明專利]一種GIV.1型諾如病毒的RT-LAMP法檢測用成套引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201910976389.6
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110684867B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 韓一芳;葉福強;張錦海;王太武;張琪;汪春暉;曹猛;王長軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍東部戰區疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 周海斌

1.一種GIV.1型諾如病毒的RT-LAMP法檢測用成套引物，其特征是，所述成套引物包括外引物對GIV-F3和GIV-B3，內引物對GIV-FIP和GIV-BIP，以及環引物對GIV-LF和GIV-LB；GIV-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，GIV-B3的序列如SEQ ID NO:2所示，GIV-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，GIV-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，GIV-LF的序列如SEQ ID NO:5所示；GIV-LB的序列如SEQ ID NO:6所示。

2.一種GIV.1型諾如病毒的RT-LAMP法檢測用試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括引物混合液，所述引物混合液含有權利要求1所述的成套引物。

3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征是，所述外引物對GIV-F3和GIV-B3、內引物對GIV-FIP和GIV-BIP、及環引物對GIV-LF和GIV-LB的摩爾比為1:8:(2-4)。

4.根據權利要求2所述試劑盒，其特征是，所述試劑盒還包括酶液，2×反應液，顯色液及超純水。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述酶液由濃度為6-10U/μl的BstDNA聚合酶，濃度為8-16U/μl AMV逆轉錄酶、以及水構成；

所述2×反應液由40mmol/L pH8.8的Tris-HCl，20mmol/L的KCl，20mmol/L的(NH₄)₂SO₄，質量濃度為0.2％的Triton X-100，由濃度均為2.8mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP組成的dNTPs，1.6mmol/L的甜菜堿C₅H₁₁NO₂，16mmol/L的MgSO₄，以及水構成；

所述顯色液為濃度4mmol/L的金屬離子指示劑HNB儲存液。

6.根據權利要求2所述試劑盒，其特征是，所述試劑盒還包括GIV.1型諾如病毒陽性對照品，濃度為20-100mg/L。

7.根據權利要求6所述試劑盒，其特征是，所述GIV.1型諾如病毒陽性對照品濃度為50mg/L，且由以下方法獲得：構建含有GIV.1型諾如病毒RdRp基因的質粒，進行體外轉錄反應獲得RdRp基因的RNA片段，純化后即得到GIV.1型諾如病毒陽性對照品；所述RdRp基因的序列如SEQ ID NO:7所示。

8.一種非診斷目的的GIV.1型諾如病毒RT-LAMP檢測方法，其特征是，采用權利要求2至7任一項所述的試劑盒；所述方法包括以下步驟：

第一步、向透明反應管加入試劑盒2×反應液、引物混合液、酶液、顯色液、超純水，然后混合獲得反應液；

第二步、向反應管中加入待測核酸樣品，蓋好反應管后混勻；

第三步、將反應管在恒溫條件下放置進行RT-LAMP擴增，再于反應結束條件下放置以終止反應；

第四步、觀察反應液的顏色，若反應液顏色為天藍色，則待測核酸樣品中含有GIV.1型諾如病毒；若反應液顏色為紫羅蘭色，則待測核酸樣品中不含GIV.1型諾如病毒。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征是，所述第二步中，加入待測核酸樣品后，試劑盒2×反應液、引物混合液、酶液、顯色液、超純水及待測核酸樣品的體積比為12.5：2.5：1：0.7：7.3：1，且反應管中反應液的體積為25μl；第三步中，RT-LAMP擴增條件為：62℃恒溫條件下放置60min；所述反應結束的條件為：85℃下放置5min。