[發明專利]煙草CyP71及在調控植物表皮毛發育方面的應用

在審

• 申請號: 201910976192.2
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110923249A
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 任學良;郭玉雙
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/66;C12N15/82
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 劉艷

1.一種調控植物表皮毛發育的基因，其特征在于：該基因為煙草CyP71，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種調控植物表皮毛發育的基因，其特征在于：所述的CyP71，其克隆正向引物為5'-ATGCAACTGAGATTTGAAG-3'，反向引物為5'-TCACTTTTGAGGAGGTTG-3'。

3.如權利要求1或2所述的一種調控植物表皮毛發育的基因的植物表達載體的構建及遺傳轉化方法，其特征在于：包含以下步驟：（1）以測序正確的煙草CyP71基因T克隆重組質粒為模板，酶切引物擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化；（2）對酶切引物擴增產物和pSH737進行雙酶切，37℃恒溫水浴酶切反應1.5h，酶切完成對產物進行電泳檢測并切膠回收目的片段；（3）pSH737表達載體和酶切引物擴增產物的雙酶切產物在T4連接酶的作用下，于恒溫水浴16℃連接10h，連接為重組表達載體；（4）將連接產物轉化到農桿菌LBA4404，并在其中擴增，選擇Kan LB進行抗性篩選，然后進行菌落PCR驗證其為陽性重組菌落，提取質粒并進行質粒PCR驗證，并測序，成功得到pSH737-CyP71。

4.根據權利要求3所述的一種調控植物表皮毛發育的基因的植物表達載體的構建及遺傳轉化方法，其特征在于：所述的酶切引物為：上游引物序列為5'-GCTCTAGAATGCAACTGAGATTTGAAG -3'，下游引物序列為5'-TCCCCCGGGTTATCACTTTTGAGGAGGTTG -3'。

5.根據權利要求3所述的一種調控植物表皮毛發育的基因的植物表達載體的構建及遺傳轉化方法，其特征在于：所述的雙酶切采用XbaI和SmaI進行。

6.根據權利要求3所述的一種調控植物表皮毛發育的基因的植物表達載體的構建及遺傳轉化方法，其特征在于：所述的煙草CyP71基因T克隆重組質粒的合成方法：分別利用CyP71克隆引物通過RT-PCR的方法從煙草中擴增基因，將擴增獲得的PCR產物直接按照TA克隆方法克隆到克隆中間載體:pGEM-T上，在T4 DNA連接酶的作用下，將PCR產物與T載體充分混勻，于16℃連接過夜，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，并在其中擴增，隨后進行菌落PCR和質粒PCR篩選陽性克隆，并測序即可。

7.根據權利要求6所述的一種調控植物表皮毛發育的基因的植物表達載體的構建及遺傳轉化方法，其特征在于：所述的RT-PCR反應程序為: 50℃ 30min，94℃ 2min，94℃ 30S,55-65℃ 30S，72℃ 1min/kb，30個循環。