[發(fā)明專利]運(yùn)動(dòng)金球菌麥草畏降解基因dicM的用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910973904.5
• 申請(qǐng)日: 2019-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN111139249B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張維;林敏;周正富;陸偉;郭倩楠;陳明;柯秀彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C07K14/195;C12N15/70;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)基因dicM具有降解除草劑麥草畏的功能。本發(fā)明構(gòu)建了含有該基因的重組載體，將其在原核宿主細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，所述基因在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，具有降解除草劑麥草畏的功能，可用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及運(yùn)動(dòng)金球菌dicM基因表達(dá)蛋白質(zhì)降解除草劑麥草畏的用途。

背景技術(shù)

據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)金球菌菌株分離自印度洋深海，目前沒有任何關(guān)于其功能基因及菌株生物學(xué)功能與應(yīng)用的研究文獻(xiàn)。

麥草畏(Dicamba)，是一種具有選擇性和內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗后生長素類除草劑，屬苯甲酸類除草劑，對(duì)一年生和多年生闊葉雜草有顯著防除效果，其持效期長，常被廣泛的用于小麥、玉米、谷子等作物田防除雜草。

麥草畏屬于合成生長素類除草劑，在植物體內(nèi)可以通過韌皮部和木質(zhì)部上下行傳導(dǎo)，多積累在活躍的分生組織及代謝活動(dòng)旺盛的部位，阻礙植物體內(nèi)激素的正常活動(dòng)，引起莖葉和根的畸形，細(xì)胞分裂、伸長和分化不規(guī)律，破壞核酸代謝，從而使敏感植物枯死。麥草畏易揮發(fā)，若高溫施用則會(huì)形成霧滴而漂移數(shù)十里，對(duì)鄰近敏感的闊葉作物易造成藥害，同時(shí)也會(huì)造成作物減產(chǎn)。

近年來，隨著麥草畏的過度使用，造成其在土壤中的殘留十分嚴(yán)重，因此，越來越多的科研工作者開始研究麥草畏在土壤中的降解問題。目前，對(duì)麥草畏的降解機(jī)制還不清晰，無法針對(duì)靶蛋白進(jìn)行研究。僅針對(duì)麥草畏降解酶基因的克隆和獲取開展了部分研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一種新的除草劑麥草畏降解基因，其編碼的蛋白質(zhì)能夠用于麥草畏分子的降解。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種具有降解除草劑麥草畏功能的基因dicM，該基因來自于運(yùn)動(dòng)金球菌。

通過構(gòu)建了該基因的表達(dá)載體，將其在除草劑降解篩選菌株大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，所述基因在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)后，具有降解除草劑麥草畏的功能，可用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)。具體研究工作如下：

1、獲得了含有dicM基因的重組工程菌株

1)通過PCR從南方某制藥廠周圍土壤樣品的微生物宏基因組擴(kuò)增出dicM基因，該基因來自于運(yùn)動(dòng)金球菌，其大小為1086bp，該基因編碼361個(gè)氨基酸，將其克隆于載體pJET上，構(gòu)建了含有完整dicM基因的重組克隆質(zhì)粒pJET-dicM；

2)將dicM基因連接于pRAD1質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含組成型高表達(dá)groEL啟動(dòng)子，可高效持續(xù)表達(dá)下游靶標(biāo)蛋白。構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒pRAD-dicM；

3)將導(dǎo)入dicM基因的重組質(zhì)粒pRAD-dicM轉(zhuǎn)入麥草畏降解基因篩選菌株大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM-dicM(詳見實(shí)施例1)；

2、表達(dá)dicM的重組大腸桿菌工程菌株的催化活性實(shí)驗(yàn)

已有研究表明，除草劑麥草畏降解的關(guān)鍵步驟在于麥草畏分子的去甲氧基化反應(yīng)。經(jīng)過微生物酶的催化將除草劑麥草畏去甲氧基生成無除草劑活性的3,6-二氯水楊酸(DCSA)。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，向培養(yǎng)基中添加除草劑麥草畏化合物后，經(jīng)過60小時(shí)孵育，表達(dá)dicM的重組大腸桿菌工程菌株JM-dicM能夠?qū)Ⅺ湶菸贩肿油耆到猓扇ゼ谆臒o除草劑活性的DCSA。

實(shí)驗(yàn)表明，重組表達(dá)的DicM蛋白質(zhì)具有降解除草劑麥草畏的催化功能，降解產(chǎn)物主要為DCSA。該基因在抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的培育及污染土壤的生物修復(fù)方面具有應(yīng)用潛力。

序列表信息

SEQ ID NO.1：dicM基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：DicM的氨基酸序列。

附圖說明：