[發明專利]一種利用超聲勻漿從紫貽貝加工下腳料中提取抗菌肽的制備方法

有效

• 申請號: 201910973827.3
• 申請日: 2019-10-14
• 公開（公告）號: CN110724175B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 余輝;莊黛娜;陳小娥;方旭波
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K1/16;C07K1/36
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

本發明屬于抗菌肽技術領域。本發明公開了一種利用超聲勻漿從紫貽貝加工下腳料中提取抗菌肽的制備方法，其包括預處理、超聲勻漿粗提、固相萃取柱富集、凝膠柱和C18色譜柱分離等步驟。本發明中紫貽貝抗菌肽的制備方法工藝簡單且成本較低；采用固相萃取柱、凝膠柱和C18色譜柱對紫貽貝抗菌肽進行富集、分離，操作方便且抗菌肽純度較高、易于工業化生產，所制備的抗菌肽的抑菌效果較強。

技術領域

本發明涉及抗菌肽技術領域，尤其是涉及一種利用超聲勻漿從紫貽貝加工下腳料中提取抗菌肽的制備方法。

背景技術

紫貽貝（Mytilus edulis Linnaeus）俗稱“海紅”、“淡菜”，在我國黃海、渤海、東海和南海北部廣泛分布，是我國主要的海洋經濟貝類。紫貽貝生產季節性強、產量大、鮮活易腐且不耐貯藏，因此促進了紫貽貝加工業的蓬勃發展，可加工中會產生大量的下腳料——含閉殼肌的熟貝殼、蒸煮液、受損和無商業化價值紫貽貝（6cm，蛋白含量為10~23%）等。目前，對于該下腳料利用研究主要集中于貝殼和蒸煮液，如貝殼粉（CaCO₃）/貝殼煅燒粉（CaO）作為PP塑料填充料、農殘/重金屬吸附劑、乙醇合成催化劑、食源性致病菌抑菌劑以及蒸煮液制備海鮮調味品與貽貝多糖等，而受損和無商業化價值紫貽貝的利用研究相對較少，筆者僅見Beaulieu等[Beaulieu L, Thibodeau J, Bonnet C, et al. Evidence of anti-proliferative activities in blue mussel (Mytilus edulis) by-products[J].Marine drugs, 2013, 11(4): 975-990.]利用復合蛋白酶水解制備抗增殖活性多肽的研究。因此需對其加以開發利用研究，開發多種產品，進一步提高和拓展其應用價值。

近年來，隨著細菌對抗生素耐藥性、抗生素殘留等問題日益嚴重，亟需尋找新型抗菌活性物質，因而從自然界中獲得天然抗菌活性物質引起了研究者的極大興趣。濾食性動物貽貝長期生活在富含各種微生物水環境中（菌落總數高達6 log CFU/mL），由于貽貝缺乏特異性的免疫系統，所以其免疫防御主要通過細胞（吞噬、包囊和呼吸爆發等）和體液（凝集素、溶酶體酶、抗菌因子等）進行免疫防御。相對于其它雙殼貝類來說，抗菌肽在貽貝抵御致病菌侵襲中發揮著重要作用。抗菌肽具有抑菌活性強、抑菌譜廣、不產生耐藥性以及無有害殘留等優點，所以利用紫貽貝加工下腳料高效提取海洋生物抗菌肽，是紫貽貝加工下腳開發研究的方向。因此，開發出工藝簡單可行，得率高且抑菌效果好的貽貝抗菌肽，不僅進一步拓展紫貽貝應用范圍，而且也提高貽貝加工下腳料的附加值。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種紫貽貝抗菌肽的得率較高、抑菌效果好并且具有工藝簡單等特點的利用超聲勻漿從紫貽貝加工下腳料中提取抗菌肽的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種利用超聲勻漿技術從紫貽貝加工下腳料中提取抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：

a）預處理：紫貽加工下腳料（受損和無商業化價值紫貽貝）半解凍后，取肉、清洗，瀝干后凍藏備用；

b）粗提：將紫貽貝肉與乙酸溶液混合并煮沸，冰水浴冷卻；冰水浴中超聲勻漿處理，超聲勻漿處理后離心處理得到上清液A，將上清液A冷凍干燥得到粗提物；

c）固相萃取：將粗提物溶解于三氟乙酸溶液中并離心處理得到上清液B，將上清液過固相萃取柱1～2次，接著依次用三氟乙酸溶液和乙腈溶液洗脫處理，收集乙腈洗脫液并冷凍干燥制得抗菌肽粗品A；

d）凝膠柱分離：將抗菌肽粗品A用水溶解，離心處理得到上清液C，然后在凝膠柱中分離純化，收集合并洗脫峰并冷凍干燥制得抗菌肽粗品B；

e）色譜柱分離：將抗菌肽粗品B配制成多肽溶液，離心處理得到上清液D并進行色譜柱分離處理，收集合并洗脫峰，冷凍干燥后制得紫貽貝抗菌肽。